La technique CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) est une méthode d'édition du génome de troisième génération qui a révolutionné le monde grâce à son haut débit. Elle est utilisée pour traiter diverses maladies et infections. De nombreuses bactéries et autres procaryotes (comme les archées) possèdent également des systèmes CRISPR/Cas9 pour se défendre contre les phages. Il a été démontré que les stratégies basées sur CRISPR/Cas9 peuvent inhiber la croissance et la progression du cancer du sein triple négatif (CSTN) en ciblant des gènes de résistance potentiellement altérés, la transcription et la régulation épigénétique. Ces interventions thérapeutiques pourraient contribuer à résoudre des problèmes complexes tels que la résistance aux médicaments observée même dans le CSTN. Actuellement, différentes méthodes sont utilisées pour administrer CRISPR/Cas9 aux cellules cibles, notamment des méthodes physiques (micro-injection, électroporation et modes hydrodynamiques), virales (virus adéno-associé et lentivirus) et non virales (liposomes et nanoparticules lipidiques). Bien que divers modèles aient été développés pour étudier les causes moléculaires du cancer du sein triple négatif (CSTN), le manque de méthodes sensibles et ciblées pour l'administration in vivo d'outils d'édition du génome limite leur application clinique. En résumé, cette revue examine de manière exhaustive les progrès, les défis, les limites et les perspectives du traitement du CSTN par CRISPR/Cas9, en s'appuyant sur les données probantes actuelles. Nous soulignons également comment l'association de l'intelligence artificielle et de l'apprentissage automatique peut améliorer les stratégies CRISPR/Cas9 dans le traitement du CSTN.
Le cancer se caractérise par une division cellulaire incontrôlée, une perturbation des points de contrôle du cycle cellulaire et des mutations des gènes suppresseurs de tumeurs (GST) (Matthews et al., 2022). Parmi les différents types de cancer, le cancer du sein est le plus fréquent chez la femme et présente un taux de mortalité élevé à l'échelle mondiale (Waks et Winer, 2019). Le cancer du sein est une maladie hétérogène aux caractéristiques diverses, notamment histologiques et biologiques, cliniques et comportementales, ainsi que la réponse au traitement (Weigelt et al., 2010). La classification du cancer du sein fournit des informations précises pour le diagnostic et le pronostic. L'utilisation de biomarqueurs communs et de caractéristiques clinicopathologiques constitue le principal critère de classification (Tsang et Tse, 2019). Le pronostic et la réponse au traitement du cancer du sein sont influencés par de nombreux facteurs, notamment la présence des récepteurs aux œstrogènes (ER), à la progestérone (PR), du récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2/neu), ainsi que le grade histologique, le type et la taille de la tumeur et la présence de métastases ganglionnaires (Al-Tubaiti, 2020). Cinq sous-types moléculaires intrinsèques de cancer du sein ont été identifiés : luminal A, luminal B, HER2-enrichi, basal-like et claudin-low (Prat et al., 2015). Le cancer du sein triple négatif (TNBC) est un sous-type moléculaire qui n’exprime pas tous les récepteurs ER, PR et HER2 (Yin et al., 2020). Ces caractéristiques pathologiques sont associées au TNBC, confirmant sa progression rapide et son caractère plus agressif que celui des autres types de cancer du sein (Feng et al., 2018). Par ailleurs, Peru et al. (2000) ont utilisé la technologie des puces à ADN pour reclasser le cancer du sein et identifier cinq sous-types intrinsèques (Cadenas, 2012). Le cancer du sein de type basal est un sous-type présentant un phénotype triple négatif et associé à une progression rapide. Il est important de noter que tous les cancers du sein de type basal sont fréquemment confondus avec des cancers du sein triple négatifs (CSTN), alors que seulement 77 % d'entre eux le sont réellement. En revanche, 71 à 91 % des CSTN sont de type basal, ce qui indique un chevauchement entre ces deux types de cancer du sein et des classifications distinctes (Wang D.-Y. et al., 2019). Ceci souligne la nécessité de caractériser l'hétérogénéité des CSTN afin d'affiner le pronostic et d'identifier les réponses potentielles aux traitements actuels et futurs. De plus, les CSTN représentent 15 à 20 % de tous les cas de cancer du sein et sont plus fréquents chez les femmes de moins de 50 ans. Des mutations des gènes BRCA1 ou BRCA2 ont été rapportées dans environ 20 % des cas de cancer du sein triple négatif (CSTN) (Xie et al., 2017 ; Tzikas et al., 2017, 2020). Des études ont également montré que le CSTN présente un microenvironnement immunitaire particulier, caractérisé par des taux élevés de facteurs de croissance de l’endothélium vasculaire, de macrophages associés aux tumeurs (TAM), de lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) et d’autres molécules impliquées dans la croissance et la migration tumorales. Par conséquent, la compréhension du microenvironnement du CSTN est essentielle pour son pronostic et son traitement (Fan et He, 2022).
Pour évaluer le pronostic du cancer du sein triple négatif (CSTN) et garantir un traitement efficace, un diagnostic précis est essentiel. Ce diagnostic repose principalement sur l'immunohistochimie (IHC) pour la détection des récepteurs aux œstrogènes (ER), à la progestérone (PR) et HER2, et sur la mammographie pour la détection des néoplasies mammaires. Cependant, la mammographie ne permet pas de visualiser correctement les caractéristiques intratumorales telles que la nécrose et la fibrose (Deepak Singh et al., 2021). Un pronostic et un diagnostic défavorables empêchant les médecins de prescrire le traitement approprié (Chaudhary, 2020), diverses stratégies sont mises en œuvre pour améliorer la prise en charge des patientes atteintes de CSTN. Actuellement, deux médicaments, la doxorubicine et le cyclophosphamide, sont utilisés chez ces patientes et ont montré de bons résultats. D'autres sels de platine, comme le carboplatine et le cisplatine, sont également utilisés (Sikov et al., 2015). De plus, des inhibiteurs de PARP tels que l'olaparib, le vélaparib et le PF-01367338 ont été utilisés comme agents de chimiothérapie potentiels pour le traitement du cancer du sein triple négatif (CSTN) (Ishino et al., 2018). Les voies de signalisation Wnt/β-caténine, NOTCH et Hedgehog étant impliquées dans l'apparition et la progression du CSTN, le ciblage de ces voies par des médicaments pourrait constituer une stratégie importante (Aysola et al., 2013). Bien que la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie demeurent les traitements de référence du CSTN, des progrès significatifs ont été réalisés dans le développement de nouvelles thérapies, notamment les thérapies ciblées, l'immunothérapie et divers outils d'édition génique liés à CRISPR, tels que Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, l'édition de précision et la thérapie génique ciblée par CRISPR/Cas9. Nous nous concentrerons ici sur les différents outils d'édition génique liés à CRISPR utilisés dans le traitement du CSTN. Parmi elles, CRISPR/Cas9 a suscité un vif intérêt.
Cas9n, également connue sous le nom de nickase Cas9, est une variante génétiquement modifiée de la protéine Cas9, issue du système d'édition génomique CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Dans sa forme originale, la protéine Cas9 contient deux domaines nucléases : RuvC et HNH, dont la fonction principale est le clivage des deux brins d'ADN. Cependant, dans Cas9n, l'un des domaines nucléases, HNH, est muté et devient inactif. Par conséquent, le domaine HNH de Cas9n est non fonctionnel. Seul le domaine RuvC reste actif, permettant à Cas9n de couper ou de créer des cassures sur des brins d'ADN simples (Trevino et Zhang, 2014). Comparée à Cas9, Cas9n réduit efficacement les effets hors cible et améliore la précision des mécanismes de réparation cellulaire. Cas9n peut être utilisée pour résoudre divers problèmes, comme la création de cassures à des endroits spécifiques dans l'ADN double brin. À cette fin, deux molécules de Cas9n ont été combinées et utilisées conjointement (Yee, 2016). La kinase à lignage mixte 3 (MLK3) est une protéine kinase activée par les mitogènes qui joue un rôle clé dans la régulation des métastases du cancer du sein triple négatif (Cronan et al., 2012).
La MLK3 peut activer de multiples voies de signalisation induisant des métastases dans le cancer du sein triple négatif (TNBC). Par exemple, la voie de la kinase JNK (c-Jun N-terminal kinase) régule la motilité cellulaire et la dégradation de la matrice extracellulaire (MEC). La MLK3 active cette voie, augmentant ainsi la motilité cellulaire et conférant des propriétés invasives (Rattanasinchai et Gallo, 2016). La MLK3 régule également la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). Pour ce faire, elle active des facteurs de transcription en aval, tels que Snail, Slug et Twist. Ces facteurs inhibent l'expression des marqueurs épithéliaux et favorisent celle des marqueurs mésenchymateux, conduisant à l'acquisition d'un phénotype métastatique (Casalino et al., 2023). Il a été observé que la MLK3 joue un rôle dans le remodelage de la MEC et l'activation de protéases, comme les métalloprotéinases matricielles (MMP), qui dégradent la MEC. Ceci facilite l'invasion des cellules tumorales et leur dissémination à distance (Katari et al., 2019). Ainsi, des études antérieures ont montré que MLK3 joue un rôle crucial dans le cancer du sein triple négatif (CSTN). Rattanasinchai et Gallo ont utilisé des modèles de CSTN pour étudier le rôle de MLK3 et ont découvert qu'il favorise le développement du cancer via des voies de signalisation spécifiques. Ils ont utilisé la technique CRISPR/Cas9n pour modifier l'expression de MLK3 et ont observé une réduction significative des métastases du CSTN (Rattanasinchai et Gallo, 2016).
La dCas9, souvent appelée Cas9 inactive, est une forme dérivée modifiée de la protéine Cas9. Contrairement à la Cas9 active, la dCas9 est dépourvue d'activité endonucléase, ce qui l'empêche d'induire des cassures double brin de l'ADN. Par conséquent, la dCas9 peut être utilisée pour cibler précisément des régions spécifiques du génome sans altérer la séquence d'ADN (Wang et al., 2016). Dans la dCas9, deux protéines endonucléases, RuvC et HNH, sont inactivées par suppression de résidus d'acides aminés importants (Richter et al., 2016). Malgré son absence d'activité de clivage de l'ADN, la dCas9 joue un rôle important en recherche génétique et en biotechnologie. Par exemple, elle permet la visualisation de régions spécifiques du génome, facilite la régulation transcriptionnelle et favorise les modifications épigénétiques (Brocken et al., 2018).
Le facteur de transcription ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) joue un rôle spécifique et crucial dans la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), un processus cellulaire intervenant au cours du développement embryonnaire, de la réparation tissulaire et de la progression tumorale. Ce processus implique la transformation des cellules épithéliales en cellules mésenchymateuses, entraînant des modifications de la morphologie, de la motilité et de l'invasivité cellulaires (Wu et al., 2020). ZEB1 inhibe plusieurs marqueurs épithéliaux, tels que l'E-cadhérine et l'occludine, responsables du maintien de l'adhérence intercellulaire et de la polarité des cellules épithéliales dans le cancer du sein triple négatif (TNBC) (Moreno-Bueno et al., 2008). De plus, ZEB1 active certains marqueurs tels que la N-cadhérine, la vimentine et la fibronectine (Konradi et al., 2014) et régule également des gènes impliqués dans le remodelage du cytosquelette, comme les GTPases Rho et les métalloprotéinases matricielles (MMP) (Huang et al., 2014). En outre, il influence diverses voies de signalisation, telles que le facteur de croissance transformant β (TGF-β) et la voie Wnt, favorisant ainsi l'invasion tumorale et les métastases dans le cancer du sein triple négatif (TNBC) (Chen et al., 2016). De nombreuses études et données scientifiques indiquent que ZEB1 présente un fort potentiel en tant qu'agent précieux pour la détection et le traitement du TNBC. Dans une étude récente, Waryah et al. ont utilisé un modèle de TNBC et ont obtenu une suppression complète de ZEB1 par dCas9. Ainsi, ils ont observé une spécificité très élevée et une inhibition presque complète de ZEB1 dans des conditions in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 est un outil d'édition génique dérivé du système CRISPR/Cas, où le terme Cas12 désigne la protéine 12 associée à CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), identique à Cas9. La seule différence réside dans la présence de la protéine Cas12. Contrairement à Cas9, Cas12 possède des fonctions uniques, comme la génération d'extrémités cohésives lors de l'édition génique, tandis que Cas9 génère des extrémités franches (Wang et al., 2021). Cette propriété de Cas12 confère à cette technologie de manipulation de l'ADN sa spécificité. Capable de reconnaître et de couper précisément l'ADN cible, cette protéine présente une polyvalence remarquable, ce qui en fait un outil efficace pour de nombreuses applications, dont l'édition génique (Pickar-Oliver et Gersbach, 2019).
À l'instar d'autres variantes de CRISPR, CRISPR/Cas12 est également capable d'inactiver ou d'activer des gènes dans le cancer du sein triple négatif (TNBC), en ciblant des gènes jouant un rôle important dans sa pathogenèse ou sa réponse au traitement (Yang et Zhang, 2023). Pour ce faire, un ARN guide (gRNA) a été développé afin de diriger Cas12 vers le gène cible. Une fois Cas12 lié à sa cible, il induit des cassures double brin dans l'ADN et active les mécanismes de réparation de l'ADN. Au cours de ce processus de réparation, des nucléotides incorrects peuvent être incorporés, entraînant des mutations géniques et une perte de fonction (Zhang et al., 2021a). Par ailleurs, une version améliorée de l'enzyme Cas12 (dCas12) a également été utilisée pour activer des gènes. En la combinant à un activateur de transcription, il est possible d'induire l'expression de certains gènes et, par conséquent, de les activer. Cette technologie présente un fort potentiel pour favoriser l'activation des gènes suppresseurs de tumeurs (Sultan et al., 2022).
L'édition de précision est une technologie d'édition du génome récemment développée et extrêmement performante. Elle permet de modifier l'ADN d'un organisme avec une grande précision (Chen et Liu, 2023). L'édition de précision repose sur l'intégration de deux composants principaux : une enzyme CRISPR/Cas9 modifiée et une transcriptase inverse. L'enzyme CRISPR/Cas9 cible sélectivement des sites précis du génome, tandis que la transcriptase inverse permet de modifier l'ADN en profondeur à l'emplacement ciblé (Hassan et al., 2021). Dans le mécanisme d'édition de précision, la première étape consiste à créer un ARN guide d'édition de précision (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Ce guide contient la séquence cible et la matrice d'ARN correspondant au site d'édition souhaité dans l'ADN cible. Le pegRNA est ensuite introduit dans les cellules cibles avec une nucléase d'édition de précision (PE2). PE2 est une protéine de fusion composée d'une enzyme Cas9, d'une transcriptase inverse et d'un adaptateur d'édition d'amorce (Martín-Alonso et al., 2021). À l'intérieur de la cellule, les complexes pegRNA-PE2 recherchent l'ADN spécifique qu'ils souhaitent modifier. L'enzyme Cas9 coupe l'ADN et crée une matrice constituée de brins simples (Choi et al., 2022). La transcriptase inverse utilise cette matrice pour préparer l'ADN à l'édition. Outre la copie de l'ADN, elle inclut également les instructions nécessaires à l'édition de la matrice d'ARN. Enfin, le brin d'ADN nouvellement créé sert de matrice pour réparer la cassure, ce qui génère une séquence d'ADN modifiée portant la modification souhaitée (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Les mécanismes d'édition d'amorce peuvent induire des mutations généralisées dans les gènes. Ils peuvent cibler les mutations ponctuelles, les insertions, les délétions et même les remplacements de gènes (Anzalone et al., 2019 ; Chen et Liu, 2023). L’édition de précision offre plusieurs avantages par rapport aux technologies d’édition du génome précédentes. Il s’agit notamment d’une précision accrue, d’une réduction des effets hors cible et de la possibilité de modifier l’ADN sans recourir à des cassures double brin (Anzalone et al., 2020).
La technologie CRISPR/Cas9 a été initialement développée pour protéger les bactéries contre le transfert de plasmides et l'infection par des phages. Elle a ensuite été réorientée vers un outil efficace de ciblage de l'ADN basé sur l'ARN pour l'édition du génome (Jiang et Doudna, 2017). De plus, le système CRISPR/Cas9 serait présent dans 50 % des génomes bactériens et 87 % des génomes archéens (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 est un outil potentiel pour la suppression, l'insertion et la correction de toute séquence génétique anormale, aussi bien in vivo qu'in vitro (Sabit et al., 2021). Par ailleurs, il a été démontré que CRISPR/Cas9 fait partie du système immunitaire adaptatif en raison de sa spécificité pour les gènes cibles d'intérêt (Chen et Zhang, 2018).
Le système CRISPR/Cas9 est composé de la protéine Cas9 et d'un ARN guide unique (sgRNA). Cas9 est une endonucléase constituée de plusieurs sous-unités protéiques. De plus, Cas9 possède des propriétés structurales et conformationnelles uniques (Pacesa et al., 2022), car elle est composée de deux lobes : le lobe de reconnaissance (REC) et le lobe de nucléase (NUC). Le lobe REC est lui-même divisé en trois régions : REC1, REC2 et les hélices de pontage (Cromwell et al., 2018). Le lobe NUC est composé de trois sous-unités : RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH et le domaine d'interaction avec le motif adjacent au protospacer (PAM) (Fig. 1) (Song et al., 2016). Le sgRNA est composé de deux éléments : l'ARN CRISPR (crRNA) et le petit ARN transcodant (ARN traceur) (Figure 1). L'ARNsg lie la protéine Cas9 aux connexines pour former un complexe actif, également appelé complexe effecteur (Richter et al., 2012). L'ARNcr, une paire de bases de 18 à 20 nucléotides, joue un rôle crucial dans la reconnaissance des séquences d'ADN cibles. De plus, l'ARNcr s'apparie à l'ADN cible, et l'ARNtracr sert d'échafaudage à la nucléase Cas9 pour se lier à l'ADN cible (Manghwar et al., 2019). Par ailleurs, la séquence PAM, composée de 3 nucléotides, confirme, spécifie et module la liaison du complexe effecteur à l'ADN. Les sous-unités RuvC et HNH du complexe protéique Cas9 possèdent une activité catalytique (Richter et al., 2012 ; Asmamaw et Zawdie, 2021). Le domaine nucléase HNH de la sous-unité Cas9 clive le brin d'ADN associé à l'ARNcr. Le domaine nucléase RuvC clive d'autres brins d'ADN et génère des cassures double brin (DSB), après quoi deux mécanismes de réparation des cassures d'ADN différents sont activés (Jiang et Doudna, 2017) (Figure 1).
Figure 1. Vue d'ensemble du système CRISPR/Cas9 (A). Composants du système CRISPR/Cas9 : (i) l'endonucléase Cas9, responsable de la coupure de la séquence d'ADN cible ; (ii) un ARN guide unique (sg-ARN) résultant de la fusion de chimères crRNA et tra-crRNA. (iii) Cas9 comprend plusieurs composants tels que Rec I, Rec II, le lobe NUC (HNH et Ruv C sont des sous-composants) et le domaine d'interaction PAM (C), chacun ayant une fonction spécifique. Le complexe protéique CRISPR/Cas9 clive les séquences d'ADN en formes non complémentaires et complémentaires (D). CRISPR/Cas9 modifie le génome en trois étapes : reconnaissance, coupure et réparation. L'ARN guide unique (sg-ARN) conçu pour guider Cas9 reconnaît la séquence cible grâce au composant complémentaire crRNA. Cas9 reconnaît la séquence PAM en 5′-NGG-3′ et fusionne l'ADN, formant un hybride ADN-ARN et activant ainsi la coupure. Le domaine HNH de Cas9 clive le brin complémentaire, et le domaine RuvC clive le brin non complémentaire. Le système CRISPR/Cas9 répare l'ADN double brin en le fragmentant de deux manières : la jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) et la réparation dirigée par homologie (HDR). La NHEJ répare l'ADN double brin en l'absence d'ADN homologue étranger par un processus enzymatique, un mécanisme sujet aux erreurs qui peut insérer ou supprimer des séquences d'ADN aléatoires. La HDR est très spécifique et nécessite des matrices d'ADN homologues.
Les voies de réparation médiées par CRISPR/Cas9 comprennent la jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) et la réparation dirigée par homologie (HDR). La NHEJ est une voie sujette aux erreurs car elle implique l'insertion ou la délétion et ne requiert aucun motif spécifique lors du processus de réparation. Elle utilise des nucléotides aléatoires pour générer des protéines standard (Abbasi et al., 2021). Ce système de réparation est composé de quatre complexes : le complexe KU, le complexe protéique de complémentation croisée de type 4 (XRCC-4), l'enzyme de traitement des extrémités de l'ADN et la protéine kinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Le complexe protéique KU est composé de deux sous-unités, Ku70 et Ku80, et joue un rôle important dans le mécanisme de NHEJ. En effet, la réparation est initiée par la liaison de ces deux sous-unités aux extrémités franches ou quasi-frances de l'ADN cible (Abbasi et al., 2021), servant d'échafaudage pour le recrutement d'autres facteurs liés à la NHEJ sur le site de la lésion (Yang et al., 2020). XRCC-4 et la ligase d'ADN sont composés respectivement de 334 et 911 acides aminés, et le complexe XRCC4-ligase d'ADN IV stimule la ligation des extrémités d'ADN (Chatterjee et al., 2015). L'enzyme de traitement des extrémités d'ADN, également connue sous le nom de polynucléotide kinase 3′-phosphate, est une enzyme de traitement des extrémités d'ADN. Elle peut éliminer le groupe 3′P de l'ADN et phosphoryler le groupe 5′OH lors de la réparation des cassures double brin (DSB). Ce processus implique également la réparation des cassures simple brin (CSB) via la voie de réparation des CSB (Chatterjee et al., 2015). La protéine kinase DNA-PKcs est une protéine kinase ADN-dépendante composée d'une sous-unité catalytique appartenant à la famille des PIKK (kinases apparentées à la phosphatidylinositol 3-kinase) et de la protéine ATM (ataxie télangiectasie mutée), ainsi que des ATR apparentées à ATM et Rad3. Elle intervient également dans la réparation des cassures double brin (CDB) et des cassures simple brin (CSB) (Yue et al., 2020 ; Peng et al., 2016).
La recombinaison homologue (HDR) est un mécanisme de réparation plus précis et adapté, car l'information est copiée à partir de la structure intacte de la double hélice d'ADN homologue, bien qu'elle nécessite la présence de chromatides sœurs. Ce processus se déroule durant la phase S/G2 du cycle cellulaire des mammifères. La HDR est principalement observée chez les levures, tandis que la jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) est essentielle chez les mammifères (Burma et al., 2006 ; Abbasi et al., 2021). Le mécanisme de réparation complet est illustré dans la figure 1.
Le cancer du sein triple négatif (TNBC) étant causé par des anomalies génétiques et épigénétiques, la correction de ces anomalies malignes par CRISPR/Cas9 pourrait constituer une approche thérapeutique pertinente (Chen et al., 2019). De plus, certains facteurs de transcription impliqués dans la régulation transcriptionnelle spécifique aux cellules cancéreuses présentent des caractéristiques uniques, suggérant que la régulation transcriptionnelle pourrait être une excellente piste pour le traitement du cancer (Drost et al., 2017). L'exploitation de ces caractéristiques moléculaires tumorales, telles que les anomalies génétiques, épigénétiques et transcriptionnelles, pour le développement de médicaments peut améliorer les résultats cliniques et réduire les coûts de dépistage. CRISPR est un outil d'édition génique prometteur qui permet non seulement de détecter et d'identifier les cibles génomiques cancéreuses, mais aussi de modifier, de supprimer et de moduler épigénétiquement les oncogènes dans les cellules humaines (Tableau 1) (Ahmed et al., 2021). Plusieurs criblages CRISPR ont été menés afin d'identifier les gènes associés aux suppresseurs de tumeurs, aux oncogènes et à la résistance aux médicaments. L’utilisation de CRISPR/Cas9 pour modifier divers oncogènes TNBC est illustrée dans la figure 2.
Figure 2. Modification génique de divers oncogènes du cancer du sein triple négatif (TNBC) par la technique CRISPR/Cas9, entraînant une réduction de la croissance tumorale et des métastases. Ces oncogènes comprennent CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 et CXCR7, Crypto1, ROR1 et ST8SIA, impliqués dans l'apparition et la métastase du TNBC.
La migration, l'invasion et la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) des cellules cancéreuses sont associées à ITGA9. Des études antérieures ont montré qu'ITGA9 est un acteur clé de la voie Notch et joue un rôle important dans les métastases du rhabdomyosarcome (Molist et al., 2020). De plus, ITGA9 est étroitement associé au pronostic des patientes atteintes de plusieurs types de tumeurs, dont le cancer du sein (Wang Z. et al., 2019). Par ailleurs, l'analyse bioinformatique d'ITGA9 a révélé que son expression dans le cancer du sein triple négatif (CSTN) était significativement plus élevée que dans les autres sous-types de cancer du sein. Des niveaux élevés d'ITGA9 sont associés aux métastases et aux rechutes chez les patientes atteintes de CSTN. L'inactivation d'ITGA9 par CRISPR/Cas9 a induit des propriétés similaires à celles des cellules souches cancéreuses (CSC), une angiogenèse tumorale, une croissance tumorale et une réduction des métastases en favorisant la dégradation de la β-caténine dans le CSTN (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1, membre de la famille du TGF-β, est essentiel à l'embryogenèse précoce, au maintien des cellules souches et aux métastases cancéreuses (Ishii et al., 2021). Également connu sous le nom de Tdgf-1, c'est une protéine de signalisation oncogénique ancrée au GPI, impliquée dans la régulation de la formation de la ligne primitive, du mésoderme et de l'endoderme, ainsi que dans l'établissement de l'asymétrie gauche-droite lors du développement des organes au cours de l'embryogenèse (Zhang et al., 2021b). De plus, Crypto-1 est impliqué dans la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) en tant que marqueur de cellules souches (Zhang et al., 2021b). La TEM est cruciale non seulement pour divers processus tels que le développement embryonnaire, la fibrose et la cicatrisation, mais aussi pour l'invasion et la métastase cancéreuses. De plus, il a été démontré que Crypto-1 interagit avec quatre récepteurs Notch et favorise leur maturation post-traductionnelle (Brandstadter et Maillard, 2019). La voie de signalisation Notch est impliquée dans le maintien des cellules cancéreuses du sein chez l'humain. Des études ont montré que l'inactivation de Crypto-1 par la technique CRISPR/Cas9 supprime la croissance tumorale et les métastases. Par conséquent, Crypto-1 pourrait constituer une cible thérapeutique importante pour le cancer du sein triple négatif (Castro et al., 2015).
La protéine XCL12 et ses récepteurs de chimiokines CXC (CXCR4 et CXCR7) jouent divers rôles dans la prolifération, la croissance, la migration et l'invasion des cellules cancéreuses (Wu et al., 2015). Ces chimiorécepteurs ont été associés au développement du cancer du sein triple négatif (CSTN) via de multiples voies de signalisation, dans des modèles in vivo et in vitro (Wu et al., 2015). De plus, l'activation de CXCR4 et CXCR7 est associée à une plus grande susceptibilité aux métastases et à un mauvais pronostic dans le CSTN (Karn et al., 2022). Par conséquent, l'inactivation des gènes CXCR4 et CXCR7 pourrait constituer une cible thérapeutique efficace pour le traitement du cancer du sein, y compris le CSTN. Dans une étude menée par Yang et al. (2019), ces auteurs ont utilisé la technique CRISPR/Cas9 pour inactiver simultanément les gènes CXCR4 et CXCR7 et ont constaté une inhibition significative de la prolifération, de la croissance, de la migration et de l'invasion des cellules de CSTN.
Des niveaux accrus de miR-3662, un oncogène du cancer du sein triple négatif (TNBC), ont été observés dans les tissus mammaires cancéreux (Yi et al., 2022). L'inhibition de l'expression de miR-3662 a démontré son efficacité pour inhiber la croissance tumorale et les métastases du cancer du sein, in vivo et in vitro (Agarwal et Gupta, 2021). HBP-1, un puissant inhibiteur de la voie de signalisation Wnt/β-caténine, est probablement responsable de la croissance des cellules TNBC induite par miR-3662. Récemment, Yi et al. ont découvert que l'axe miR-3662-HBP1 régule la voie de signalisation Wnt/β-caténine dans les cellules TNBC (Yi et al., 2022). Du fait de son expression spécifique aux tumeurs, miR-3662 pourrait constituer une cible thérapeutique potentielle pour le TNBC. Ainsi, l'inhibition de l'expression de miR-3662 par la technique CRISPR/Cas9 pourrait représenter une approche prometteuse pour le développement de nouveaux médicaments destinés au traitement du TNBC.
UBR5 est une nucléophosphoprotéine de 300 kDa identifiée comme un régulateur clé de la tumorigénèse, des métastases et de la réponse immunitaire dans divers cancers (Shearer et al., 2015 ; Fu et al., 2023). Il a été rapporté que l'expression d'UBR5 est fortement augmentée dans les échantillons de cancer du sein triple négatif (TNBC) et qu'elle stimule la fonction d'ERα en induisant la prolifération via son activité d'ubiquitine ligase (Bolt et al., 2015). Des études de séquençage de l'exome entier d'échantillons primaires de TNBC ont également montré une expression accrue d'UBR5, suggérant son rôle dans le développement de ce cancer. De plus, la délétion d'UBR5 par la technique CRISPR/Cas9 a induit une inhibition significative des métastases et de la croissance du TNBC dans des modèles murins expérimentaux. Par ailleurs, l'introduction d'UBR5 dans un modèle murin de type sauvage a restauré sa pleine fonctionnalité, alors que cet effet n'a pas été observé dans les souches mutantes inactivées (Liao et al., 2017). L'absence d'UBR5 est associée à une augmentation de l'apoptose, de la nécrose et à une inhibition de la croissance tumorale dans le cancer du sein triple négatif (TNBC) en raison d'une angiogenèse déficiente. La perte d'UBR5 réduit la dissémination tumorale vers les organes distants et induit une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) anormale, principalement en diminuant l'expression de l'E-cadhérine (Zhang et Weinberg, 2018). Récemment, il a été démontré qu'UBR5 est un facteur crucial dans la transcription de PD-L1 induite par l'IFN-γ dans le TNBC, du fait de son absence d'activité d'ubiquitination E3. L'analyse du transcriptome a révélé qu'UBR5 pourrait avoir des effets systémiques sur les gènes associés à la voie de signalisation de l'IFN-γ et favoriser la transactivation de PD-L1 en augmentant les niveaux d'activation de la protéine kinase A (PKR) et de ses transducteurs de signal et activateurs de la transcription 1 (STAT1) et du facteur de régulation de l'interféron 1 (IRF1). Cependant, l'ablation combinée de l'expression d'UBR5 et de PD-L1 par CRISPR/Cas9 présente un effet thérapeutique synergique par rapport à l'inhibition de chaque gène pris isolément, avec des effets profonds sur le microenvironnement tumoral (Wu et al., 2022). Ainsi, CRISPR/Cas9 pourrait constituer un outil important pour inhiber la fonction d'UBR5, et par conséquent supprimer les métastases et la croissance tumorale du cancer du sein triple négatif.
ROR1 est une protéine transmembranaire de type I exprimée lors du développement embryonnaire et du développement cancéreux, et identifiée comme une protéine onco-fœtale (Nicholas Borcherding, 2014). Le comportement invasif de divers cancers humains est associé à une surexpression de ROR1. Des résultats prometteurs ont été obtenus lors d'études in vivo et in vitro impliquant des composés thérapeutiques ciblant ROR1 (Chien et al., 2016). Des niveaux élevés d'ARNm de ROR1 dans les biopsies de tissu mammaire ont également été associés à des tumeurs mammaires de type basal (BL) agressives et à leur migration vers d'autres parties du corps. De plus, la surexpression de ROR1 a été identifiée comme un marqueur pronostique du développement du cancer du sein triple négatif (TNBC) (Chien et al., 2016). Par conséquent, l'inhibition de ROR1 par la technique CRISPR/Cas9 pour supprimer la croissance et la métastase du TNBC constituerait une stratégie efficace.
La sialylation consiste en l'ajout d'acide sialique aux glycoconjugués, une réaction catalysée par les sialyltransférases (ST). ST8SIA1 appartient à la famille des ST et joue un rôle important dans la pathogenèse de diverses maladies telles que la leucémie lymphoïde et le cancer colorectal (Chang et al., 2018). L'analyse de la séquence d'ARN montre que ST8SIA1 est fortement exprimée dans le tissu mammaire des patientes atteintes d'un cancer du sein triple négatif (TNBC) et est corrélée positivement avec les mutations du gène suppresseur de tumeur p53, ce qui pourrait contribuer à la pathogenèse du TNBC (Battula et al., 2017). De plus, ST8SIA1 est impliquée dans les métastases et les récidives du TNBC, suggérant son rôle important dans l'apparition et le développement de cette maladie. Dans un modèle in vitro de cancer du sein triple négatif (CSTN), l'inhibition de l'expression de ST8SIA1 par CRISPR/Cas9 a permis de bloquer la croissance et la métastase (Battula et al., 2017). Ceci suggère que CRISPR/Cas9 pourrait constituer un outil important pour inhiber la fonction de l'oncogène ST8SIA1 dans le traitement du CSTN.
La NAT1 est une enzyme métabolique qui catalyse la formation de composés xénobiotiques de phase II et est exprimée dans la quasi-totalité des tissus humains. La NAT1 peut utiliser le cofacteur folate pour cibler l'acétyl-CoA, même en l'absence du substrat amine aromatique (Stepp et al., 2015 ; Laurieri et al., 2014). Des études ont montré que la NAT1 régule la fonction de la métalloprotéinase matricielle 9 (MMP9) dans des modèles de cellules de cancer du sein et protège contre les espèces réactives de l'oxygène (ROS) lors d'une carence en glucose (Wang et al., 2018). La délétion de la NAT1 inhibe le complexe pyruvate déshydrogénase, entraînant un dysfonctionnement mitochondrial (Wang L. et al., 2019). De plus, plusieurs autres études ont montré que l'inhibition de NAT1 par de petites molécules et l'utilisation d'ARNsi peuvent réduire l'invasivité et la prolifération des cellules cancéreuses du sein (Stepp et al., 2018). Récemment, la technique CRISPR/Cas9 a été utilisée pour supprimer l'expression de NAT1 dans la lignée cellulaire de cancer du sein MDA-MB-231, ce qui a influencé le métabolisme cellulaire en fonction de son niveau d'expression. Cette étude a également démontré que NAT-1 est essentiel à la progression et à la métastase du cancer du sein triple négatif (Carlisle et al., 2020).
La transcription coordonnée des oncogènes est régulée par des super-amplificateurs, des facteurs de transcription et des cofacteurs (Hnisz et al., 2015). De plus, un groupe de kinases cycline-dépendantes (CDK), telles que CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 et CDK13, est nécessaire à cette régulation transcriptionnelle. Parmi elles, CDK7 intervient dans la phosphorylation de l'ARN polymérase II, essentielle à l'initiation et à l'amplification de la transcription des oncogènes dans la pathogenèse du cancer du sein triple négatif (TNBC). Une étude fondamentale a montré que la délétion de CDK7 par CRISPR/Cas9 inhibait le TNBC, indiquant ainsi que la pathogenèse de ce cancer est dépendante de CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Des études ont montré que des mutations dans les gènes MYC et RBP (protéine de liaison à l'ARN) peuvent induire l'apoptose, tandis que des mutations isolées dans ces mêmes gènes n'affectent pas la croissance des cellules cancéreuses (Einstein et al., 2021). Plus de 1 000 RBP du génome humain ont été identifiées à l'aide d'une bibliothèque basée sur la technologie CRISPR/Cas9. Parmi elles, 57 RBP se sont révélées essentielles à la croissance des cellules cancéreuses présentant des niveaux de MYC fortement élevés (Wheeler et al., 2020). De plus, YTHDF2 est important pour le maintien de la croissance des cellules TNBC et réduit la quantité de transcrits méthylés lors de la transcription et de la traduction à haut niveau dans les cellules cancéreuses surexprimant MYC. Par ailleurs, YTHDF2 n'est pas indispensable aux cellules cancéreuses, qui sont moins dépendantes de niveaux élevés de MYC pour prolonger la survie des patientes atteintes de TNBC (Einstein et al., 2021), ce qui suggère qu'il pourrait constituer une cible thérapeutique potentielle pour des médicaments capables de traiter le TNBC.
Les protéines à doigts de zinc (ZNF) représentent environ 1 % du génome humain. Des études ont montré que les ZNF peuvent réguler la prolifération cellulaire dans divers cancers, tels que les cancers du foie, du sein et colorectal (Zhang W. et al., 2021 ; Li et al., 2017). Des banques de gènes générées par inactivation génique (CRISPR) ont été utilisées pour cribler différents gènes suppresseurs de tumeurs (GST) dans des cellules de cancer du sein (Shalem et al., 2014). Depuis, une étude transcriptomique de cellules de cancer du sein dont le gène ZNF319 a été invalidé par CRISPR/Cas9 a démontré que ZNF319 est un gène suppresseur de tumeurs qui réduit la prolifération des cellules cancéreuses du sein et est donc impliqué dans divers mécanismes de signalisation potentiels et d'autres fonctions biologiques (Wang L. et al., 2022).
La ferroptose est un type de mort cellulaire programmée dépendant de la présence de fer. On sait que son développement est influencé par la présence de peroxydes lipidiques. De plus, il a été montré que la PKCβII présente une peroxydation lipidique précoce, et une peroxydation lipidique accrue est associée à la ferroptose. Le criblage d'une bibliothèque d'inhibiteurs de kinases par CRISPR/Cas9 a révélé que la PKCβII est impliquée dans le processus de peroxydation lipidique, crucial pour la ferroptose dans les cellules MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Par conséquent, l'inactivation de la PKCβII par CRISPR/Cas9 pourrait constituer une cible potentielle pour le traitement des maladies liées à la ferroptose (Zhang et al., 2022).
On estime que la résistance aux médicaments est responsable d'environ 90 % des décès chez les patients atteints de cancer et constitue l'un des principaux défis du traitement du cancer (Bukowski et al., 2020). Les résultats indiquent qu'un nombre important de gènes impliqués dans l'efflux de médicaments, la réparation de l'ADN, l'apoptose et diverses voies de signalisation cellulaire sont associés à cette résistance (Haider et al., 2020). Parmi eux, plusieurs gènes ont été ciblés par la technique CRISPR/Cas9 et ont montré des résultats prometteurs en termes de réduction de la résistance aux médicaments et d'amélioration de l'efficacité des traitements anticancéreux (Vaghari-Tabari et al., 2022). De plus, le criblage à haut débit de banques de gènes invalidés par CRISPR/Cas9 a permis de modifier la fonction de cibles géniques potentiellement impliquées dans la résistance aux médicaments (Shalem et al., 2015). Pour identifier les gènes de résistance au paclitaxel, le séquençage d'ARN couplé à un criblage génomique d'une banque d'ARNsg a permis d'identifier huit gènes candidats, dont l'histone désacétylase 9 (HDAC9), associés à la résistance au médicament chez les patientes atteintes d'un cancer du sein triple négatif récidivant (B et al., 2020). Dans une autre étude, une surexpression de la protéine kinase à disérine/thréonine et tyrosine (DSTYK) a été observée au cours de la survie des patientes atteintes d'un cancer du sein triple négatif traitées par chimiothérapie. De plus, l'inhibition de l'expression de DSTYK par la technique CRISPR/Cas9 a significativement augmenté l'apoptose des cellules cancéreuses résistantes aux médicaments in vitro (cellules SUM102PT et MDA-MB-468) et dans un modèle in vivo de cancer du sein triple négatif (Ogbu et al., 2021).
Bien que le cancer du sein triple négatif (TNBC) présente une activation anormale de la voie MAPK, l'efficacité clinique des thérapies ciblant MEK reste faible. Un criblage génomique par CRISPR/Cas9 a révélé que l'inhibition de PSMG2 (protéine chaperonne d'assemblage du protéome 2) sensibilise les cellules TNBC BT549 et MB468 à l'inhibiteur de MEK AZD6244. L'inhibition de l'expression de PSMG2 par CRISPR/Cas9 a altéré la fonction normale du protéasome, induisant la dégradation de PDPK1 par autophagie et améliorant ainsi la prolifération des cellules tumorales dans des modèles murins de TNBC induits par AZD6244 (inhibiteur de MEK) et MG132 (inhibiteur du protéasome). Par conséquent, l'administration synergique d'inhibiteurs du protéasome et de la MAP kinase (MEK) permet de réduire la prolifération des cellules tumorales (Wang X. et al., 2022).
La technique CRISPR/Cas9 a également été utilisée pour identifier les gènes responsables de la perte de fonction induisant une résistance au cancer du sein triple négatif (CSTN) (Shu et al., 2020). Ge et al. ont expliqué le mécanisme de résistance aux médicaments des cellules cancéreuses traitées par le JQ1, un inhibiteur du bromodomaine BET (BBDI), dans le CSTN. Grâce à CRISPR/Cas9, ils ont découvert que la délétion du gène rb1 conférait au CSTN une résistance à l'agent anticancéreux JQ1. La fonction de rb1 est donc importante dans la réponse aux médicaments à base de JQ1 dans le CSTN. Ils ont également rapporté que le paclitaxel est un inhibiteur de la kinase CDK4/6/des microtubules, et que son association avec des BBDI tels que le JQ1 pourrait offrir des réponses thérapeutiques prometteuses aux CSTN résistants aux médicaments (Ge et al., 2020).
Il a été démontré que le profil transcriptionnel des ARN longs non codants (ARNnc) est responsable de la résistance à la thérapie néoadjuvante dans le cancer du sein triple négatif (CSTN). Cette étude montre que cinq transcrits différents d'ARNnc MALAT1 sont fortement exprimés dans le CSTN. De plus, la délétion de MALAT1 par la technique CRISPR/Cas9 a augmenté la sensibilité des cellules BT-549 de CSTN au paclitaxel et à la doxorubicine, suggérant un rôle potentiel de MALAT1 dans la résistance au CSTN (Shaath et al., 2021).
Les mutations du gène BRCA1 (BRCA1m) sont hétérogènes et donc difficiles à détecter. Cibler PARP1 (poly(ADP-ribose) polymérase), partenaire de létalité synthétique de BRCA1, pourrait améliorer la chimiosensibilité des cellules TNBC porteuses de la mutation mBRCA1. L'utilisation de la technique CRISPR/Cas9 pour la délétion de PARP1 a permis d'accroître la sensibilité des cellules TNBC mutées pour mBRCA1 à des agents anticancéreux tels que la doxorubicine, la gemcitabine et le docétaxel, suggérant ainsi l'implication de PARP1 dans la résistance aux médicaments chez les patients atteints de TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Les mutations des gènes suppresseurs de tumeurs BRCA1 ou BRCA2 sont connues pour augmenter le risque de développer un cancer du sein. Le traitement de ces patientes nécessite l'utilisation d'inhibiteurs de PARP. De plus, il a été démontré que l'inactivation du facteur de récupération des nucléotides DNPH1 par CRISPR/Cas9 permet d'éliminer le nucléotide toxique 5-hydroxyméthyldésoxyuridine (hmdU) monophosphate, améliorant ainsi la sensibilité des cellules déficientes en BRCA aux inhibiteurs de PARP (Fugger et al., 2021). Par conséquent, l'association de CRISPR/Cas9 et des inhibiteurs de PARP1 pourrait constituer une stratégie thérapeutique importante pour le cancer du sein triple négatif.
Le gène de la glycoprotéine pénétrante (P-gp) est un gène de résistance aux médicaments dont l'expression est généralement augmentée dans environ 41 % des cancers du sein triple négatifs (TNBC) (Sun et al., 2020). L'efflux de médicaments induit par la P-gp a été identifié comme un régulateur clé de la résistance aux médicaments dans le cancer du sein. Les inhibiteurs de la P-gp ont démontré une sensibilité accrue aux agents anticancéreux dans le cancer du sein (Famta et al., 2021). Ainsi, l'ablation ou la suppression de la P-gp par la technique CRISPR/Cas9 et l'utilisation d'inhibiteurs de la P-gp pourraient constituer des approches très importantes pour surmonter la résistance aux médicaments dans les TNBC.
Le transporteur ABCG2 (ATP-binding cassette transporter G2) est connu pour induire une résistance aux médicaments dans le cancer du sein triple négatif (TNBC) (Palasuberniam et al., 2015). Cependant, aucune étude n'a encore établi de lien entre l'inhibition d'ABCG2 par CRISPR/Cas9 et l'inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs. PTEN pourrait potentialiser l'activation d'ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015 ; Deepak Singh et al., 2021). Par conséquent, l'utilisation de CRISPR/Cas9 pour inhiber ABCG2, combinée à un inhibiteur d'ABCG2, pourrait constituer un traitement efficace pour surmonter la résistance aux médicaments dans le TNBC. Le tableau 2 présente les gènes de résistance ciblés par CRISPR/Cas9.
Tableau 2. CRISPR/Cas9 cible divers gènes de résistance au TNBC pour sensibiliser les cellules aux médicaments anticancéreux.
Les banques CRISPR/Cas9 constituent des outils potentiels pour le criblage des mutations génétiques associées à la pathogenèse du cancer (Chan et al., 2022). Cette méthode de criblage comprend quatre étapes : (a) la construction de la banque, (b) la transduction lentivirale, (c) le criblage phénotypique et (d) l’analyse du gène cible. Bien que le cancer du sein triple négatif (CSTN) présente une activation anormale de la voie MAPK, le pronostic clinique des thérapies ciblées MEK chez les patientes atteintes de CSTN porteuses de mutations dans des gènes suppresseurs de tumeurs tels que PTEN, RB1 et TP53 est très défavorable.
De plus, un criblage par inactivation génique utilisant CRISPR/Cas9 a permis de tester la molécule la plus puissante et sélective, le déhydrocatrol, abondant dans les extraits de fleurs et de feuilles du Guatemala, afin de comprendre son effet sur les cellules MDA-MB-231. Les mécanismes de cytotoxicité cellulaire sélective et les caractéristiques de cellules souches mésenchymateuses des sous-types de cancer du sein triple négatif (TNBC) ont également été étudiés. Ce criblage basé sur CRISPR/Cas9 a également révélé que le gène HSD17B11, codant pour la 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 11, est fortement exprimé dans les cellules MDA-MB-231 et induit la production de déhydrofalcarinol spécifique à ces cellules (Grant et al., 2020). Ces résultats suggèrent que le criblage génomique par CRISPR/Cas9 présente un fort potentiel pour identifier les mécanismes sous-jacents aux propriétés anticancéreuses de composés naturels potentiels.
De plus, la vulnérabilité du cancer du sein triple négatif (CSTN) au cancer a été étudiée par un criblage CRISPR/Cas9 in vivo à l'échelle du génome, révélant un lien entre les voies oncogéniques et les voies de suppression tumorale. Il a été démontré que des composants clés des voies mTOR et Hippo jouent un rôle important dans la régulation tumorale du CSTN. Par ailleurs, des études ont montré que l'inhibition pharmacologique de mTORC1/2 et de l'oncoprotéine YAP inhibe efficacement la pathogénicité du CSTN, à l'aide d'un modèle de synergie médicament-matrice in vitro et de xénogreffes dérivées de patientes in vivo. En outre, l'inhibition de mTORC1/2 par Torin-1 stimule la macropinocytose, tandis que l'inhibition de YAP induite par la vertéporfine entraîne la mort des cellules CSTN. L'ensemble de ces résultats souligne la puissance et la robustesse du criblage CRISPR in vivo à l'échelle du génome pour identifier des traitements novateurs et efficaces contre le CSTN (Dai et al., 2021).
La dérégulation du système immunitaire est un facteur important de la tumorigénèse. Les cellules cancéreuses échappent à l'élimination immunitaire en contournant les mécanismes de défense, notamment en interférant avec l'activité des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral et en compromettant le système immunitaire. Par conséquent, le développement d'un système immunitaire amélioré pourrait constituer une approche clé pour lutter contre les tumeurs. L'utilisation de la modification génétique par CRISPR/Cas9 permet d'aborder plusieurs problèmes liés au dysfonctionnement immunitaire sous différents angles. CRISPR/Cas9 a été utilisé pour améliorer l'immunité antitumorale contre le cancer du sein par les voies suivantes (Figure 3).
Figure 3. L'immunothérapie CRISPR/Cas9 cible les cellules TNBC. La perte de CDK5 et l'inhibition de PD-L1 et CD155 renforcent le système immunitaire. De même, la perte d'A2AR et l'inhibition d'antigènes associés aux tumeurs (TAA) tels que HER2, la mucine 1 et TEM8 augmentent l'efficacité des cellules CAR-T pour détruire les cellules cancéreuses. Le criblage des lymphocytes T par CRISPR/Cas9 a montré que l'inhibition de la kinase p38 renforce l'activité antitumorale des lymphocytes T. Les lymphocytes T modifiés par CRISPR/Cas9 augmentent l'expression du TCR (récepteur des lymphocytes T), ce qui leur confère une activité antitumorale.
L'objectif de l'immunothérapie est de stimuler le système immunitaire afin qu'il attaque les cellules cancéreuses. La surexpression des protéines de points de contrôle immunitaire prévient généralement les réactions auto-immunes, mais peut aider les cancers à les éviter (Topalian et al., 2015). Ces protéines inhibent les réactions immunitaires en se liant à des récepteurs à la surface des cellules immunitaires. Plusieurs protéines de points de contrôle (telles que CD155 et PD-L1) ciblent le récepteur PD-1 sur les cellules immunitaires et sont exprimées dans le cancer du sein, en particulier dans le cancer du sein triple négatif (TNBC) (Li Y.-C. et al., 2020). L'inhibition de l'expression de PD-L1 ou de son récepteur par la technique CRISPR/Cas9 peut stimuler le système immunitaire pour qu'il attaque les tumeurs TNBC (Yahata et al., 2019). De plus, il a été démontré que la diminution de l'expression de PD-L1 par la délétion de CDK5 via CRISPR/Cas9 inhibe la croissance tumorale in vitro et in vivo (Deng et al., 2020). L’inhibition de la croissance dans des modèles in vitro et in vivo de cancer du sein suggère que la réduction de CD155 médiée par shRNA pourrait avoir un effet thérapeutique sur le cancer du sein (Gao et al., 2018).
Les cellules CAR-T expriment des CAR qui reconnaissent les antigènes associés aux tumeurs (AAT) et peuvent utiliser l'inhibition de protéines de points de contrôle immunitaire pour renforcer leur activité (Li C. et al., 2020). Dans le cancer du sein, plusieurs cibles potentielles pour la thérapie par cellules CAR-T incluent des AAT tels que HER2, la mucine 1 et TEM8 (Bajgain et al., 2018). Il a été démontré que les cellules CAR-T ciblant la mésothéline (surexprimée dans les cellules BT-459 du cancer du sein triple négatif) sont plus efficaces contre le cancer lorsque PD-1 est invalidé par CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Cependant, l'isolement des lymphocytes T chez les patients, suivi de leur modification ex vivo, est un processus long et fastidieux. Bien que les cellules T universelles puissent réduire les exigences d'isolement, les lymphocytes T du donneur exprimant l'antigène leucocytaire humain (HLA) de classe I et le récepteur des lymphocytes T (TCR) doivent être éliminés afin de prévenir les anomalies de la réaction du greffon contre l'hôte (Ren et al., 2017). En utilisant CRISPR/Cas9, la recombinaison homologue (HDR) permet d'éliminer simultanément le TCR et le HLA et d'inactiver le gène codant pour le CAR (Dimitri et al., 2017a). Des études ont montré que CRISPR/Cas9 peut être utilisé pour introduire des CAR anti-CD19 dans le locus TCR, produisant ainsi efficacement des CAR sans déplétion des lymphocytes T (Dimitri et al., 2022). Des technologies multiplex ont été développées pour générer des lymphocytes T CAR allogéniques en éliminant simultanément le TCR, la β2-microglobuline (B2M), la sous-unité HLA-I et d'autres protéines telles que PD-1 et CTLA-4, ce qui pourrait leur conférer de meilleures propriétés anticancéreuses contre le cancer du sein triple négatif (TNBC) (Eyquem et al., 2017 ; Liu et al., 2017 ; Ren et al., 2017b ; Dimitri et al., 2022).
L'utilisation de CRISPR/Cas9 pourrait améliorer l'efficacité des cellules CAR-T. L'adénosine est connue pour ses propriétés immunosuppressives et peut réduire l'immunité anticancéreuse en bloquant la fonction des lymphocytes T et en activant les récepteurs A2A de l'adénosine (A2AR) (Vigano et al., 2019). L'inhibition d'A2AR par CRISPR/Cas9 a significativement amélioré l'efficacité des cellules CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). Les lymphocytes T présentent diverses caractéristiques phénotypiques telles que la prolifération cellulaire, la différenciation, le stress oxydatif et le stress génomique. Le criblage des lymphocytes T par CRISPR/Cas9 a révélé l'inactivation de 25 kinases différentes des récepteurs des lymphocytes T. Parmi elles, la délétion de la kinase p38 a démontré une augmentation de l'activité antitumorale des lymphocytes T, indiquant que la kinase p38 est un régulateur clé de la régulation des cellules CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
Les lymphocytes T peuvent être modifiés génétiquement par la technique CRISPR/Cas9 afin de produire des TCR fortement exprimés. Le transfert de lymphocytes T génétiquement modifiés à des patients a démontré une activité anticancéreuse supérieure à celle des lymphocytes T endogènes. Par conséquent, les TCR endogènes peuvent entrer en compétition avec les TCR génétiquement modifiés chez les patients, ce qui peut impacter le potentiel de l'immunothérapie du cancer. Pour pallier ce problème, l'utilisation de CRISPR/Cas9 pour éliminer le TCR-β endogène dans les cellules receveuses, suivie du transfert de lymphocytes T exprimant le TCR-β chez les patients atteints de cancer, pourrait induire de meilleures réponses immunitaires anticancéreuses sans nécessiter de compétition sexuelle avec le TCR endogène (Fan et al., 2018). Ainsi, à l'exception des lymphocytes T modifiés par CRISPR, les TCR sont mille fois plus sensibles aux antigènes tumoraux que les lymphocytes T transduits par un TCR normal. De plus, dans diverses leucémies, les lymphocytes T modifiés par CRISPR et TCR γδ présentent une expression plus élevée des lymphocytes T CD4+ et CD8+ que ceux obtenus par transfert de TCR standard (Legut et al., 2018). Ainsi, les lymphocytes T modifiés par CRISPR/Cas9 pourraient constituer une méthode d'immunothérapie efficace contre le cancer du sein triple négatif.
Les intégrines sont des molécules d'adhérence cellulaire présentes dans les membranes transmembranaires et qui favorisent la liaison des cellules à la matrice extracellulaire (MEC) (Hamidi et Ivaska, 2018). Un dérèglement des intégrines est associé au développement et à la migration des cellules cancéreuses par altération de la matrice extracellulaire, ce qui permet la survie des cellules cancéreuses dans la circulation sanguine (Hamidi et Ivaska, 2018). L'inhibition de l'expression des intégrines par la technique CRISPR/Cas9 ralentit la progression tumorale, les métastases et la colonisation dans le cancer du sein triple négatif (CSTN). L'inhibition de l'expression de l'intégrine α5 (ITGA5) a été décrite comme réduisant la migration et la progression cellulaires dans d'autres cancers, tels que le cancer du poumon (Ju et al., 2017), suggérant que l'intégrine α5 pourrait également jouer un rôle clé dans la pathogenèse du CSTN.
La génération de souris knock-out par les méthodes traditionnelles utilisant des cellules souches embryonnaires (ES) est un processus laborieux, long et peu efficace. Il faut des mois, voire des années, pour cibler les cellules ES par recombinaison homologue, élever des souris chimères, puis les croiser avec des souris hétérozygotes afin d'obtenir une descendance homozygote. Des croisements complexes sont nécessaires pour créer des souris présentant de multiples mutations génétiques. Cependant, de nombreux problèmes sont apparus lors de l'utilisation de souris générées par ablation de cellules ES à l'aide de CRISPR/Cas9 ou par micro-injection de composants CRISPR/Cas9 dans des ovocytes fécondés monocellulaires. Par exemple, l'introduction de modifications se produit souvent au niveau de loci bialléliques et n'est pas spécifique à un gène. Il a été récemment rapporté que les cellules ES utilisant la technologie CRISPR/Cas9 peuvent insérer simultanément des mutations bialléliques dans jusqu'à 5 gènes (Nishizono et al., 2021). À cette fin, l'ARNm de Cas9 et cinq gRNA spécifiques de gènes ont été transfectés simultanément dans des cellules ES. Ceci souligne le potentiel et l'efficacité de cette procédure, bien que ces mutations aient pu être transmises lors du croisement des lignées fondatrices pour produire des souris quintuples knock-out. L'étude rapporte également une découverte surprenante : les cellules ES ne sont plus nécessaires à la création de souris génétiquement modifiées. Pour supprimer des produits géniques spécifiques, l'ARNm et l'ARN guide (gRNA) de Cas9 ont été injectés dans des embryons au stade unicellulaire. Ainsi, des lignées fondatrices knock-out ont été créées, qui peuvent théoriquement être utilisées pour étudier les conséquences de la délétion de gènes chez la souris (Qin et al., 2016). Par conséquent, CRISPR/Cas9 permet la création de souris transgéniques pour traiter le cancer du sein triple négatif (TNBC) à un coût inférieur à celui du génie génétique traditionnel. Grâce au système CRISPR/Cas, un nouveau modèle de souris knock-out a été développé, capable d'introduire avec succès des mutations ponctuelles dans un ou plusieurs gènes endogènes du TNBC. Sur la base de ce concept, des modèles animaux de TNBC peuvent également être développés en utilisant la suppression médiée par CRISPR/Cas9 de BRCA1 et p53, entraînant une perte de réparation HR, une instabilité génomique et des phénotypes mutants ( Annunziato et al., 2020 ).
Actuellement, différentes méthodes telles que la mammographie, l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et l'échographie sont utilisées pour diagnostiquer le cancer du sein triple négatif (CSTN). Cependant, ces méthodes présentent certaines limites. La mammographie est utilisée pour diagnostiquer le tissu mammaire local et non les métastases, c'est-à-dire les cellules cancéreuses qui se sont propagées à d'autres organes. L'échographie n'est pas une méthode fiable pour le diagnostic du CSTN (Chen et Lee-Felker, 2023). L'IRM est plus sensible que l'échographie et la mammographie, mais sa précision diagnostique est limitée (Sha et Chen, 2022). La biopsie tissulaire est une méthode invasive permettant d'identifier les cellules cancéreuses. Cependant, dans certains cas, une biopsie peut ne pas détecter de tissu cancéreux si l'aiguille s'écarte de la zone ciblée. De plus, elle est très coûteuse et peut être traumatisante pour la patiente. Le CSTN étant un type de cancer hétérogène, une biopsie peut ne pas fournir suffisamment d'informations sur son type. Par conséquent, une nouvelle méthode diagnostique fiable pour détecter le CSTN est nécessaire de toute urgence. Le système CRISPR/Cas9 pourrait constituer une alternative très sensible et peu invasive pour le diagnostic du cancer du sein. À cette fin, les stratégies basées sur CRISPR/Cas9 peuvent être utilisées pour améliorer les méthodes PCR dans le diagnostic du cancer du sein triple négatif (TNBC). Dans un premier temps, les protéines Cas9 et cpf1 du système CRISPR sont utilisées pour éliminer l'ADN non spécifique, puis ces deux protéines (Cas9 et cpf1) reconnaissent la séquence PAM avant de se lier à l'ADN cible (Deepak Singh et al., 2021). La PCR peut ainsi identifier les mutations associées au développement du cancer. Plusieurs études ont adopté cette stratégie basée sur CRISPR pour détecter différentes mutations dans différents cancers (Safari et al., 2019). Par conséquent, les méthodes PCR basées sur CRISPR pourraient réduire la dépendance du diagnostic du TNBC aux méthodes invasives telles que l'immunohistochimie après biopsie.
Des modifications génotypiques de la régulation des récepteurs hormonaux ont également été mises en évidence dans le cancer du sein triple négatif (CSTN) (Chen et Russo, 2009). Les stratégies de PCR basées sur CRISPR/Cas9 et utilisant des puces à ADN pour le diagnostic au point de soins permettent un suivi efficace de ces mutations (Hajian et al., 2019). Elles pourraient également fournir aux professionnels de santé des informations pertinentes sur les mutations spécifiques chez les patientes atteintes de CSTN, contribuant ainsi à améliorer leur prise en charge thérapeutique. Cependant, cette technique combinée présente des limites. Par conséquent, des recherches approfondies sont nécessaires avant que cette méthode CRISPR/Cas-PCR puisse être utilisée en pratique clinique pour le diagnostic du CSTN (Yang et al., 2019).
Date de publication : 14 octobre 2024