Le diagnostic différentiel des nodules pulmonaires identifiés par tomodensitométrie (TDM) reste un défi en pratique clinique.Ici, nous caractérisons le métabolome global de 480 échantillons de sérum, y compris des contrôles sains, des nodules pulmonaires bénins et un adénocarcinome pulmonaire de stade I.Les adénocarcinomes présentent des profils métabolomiques uniques, alors que les nodules bénins et les individus en bonne santé présentent une grande similitude dans leurs profils métabolomiques.Dans le groupe découverte (n = 306), un ensemble de 27 métabolites a été identifié pour différencier les nodules bénins et malins.L'AUC du modèle discriminant dans les groupes de validation interne (n = 104) et de validation externe (n = 111) était respectivement de 0,915 et 0,945.L'analyse des voies a révélé une augmentation des métabolites glycolytiques associée à une diminution du tryptophane dans le sérum d'adénocarcinome du poumon par rapport aux nodules bénins et aux témoins sains, et a suggéré que l'absorption du tryptophane favorise la glycolyse dans les cellules cancéreuses du poumon.Notre étude met en évidence l’intérêt des biomarqueurs métabolites sériques dans l’évaluation du risque de nodules pulmonaires détectés par tomodensitométrie.
Un diagnostic précoce est essentiel pour améliorer les taux de survie des patients atteints de cancer.Les résultats de l’essai national américain de dépistage du cancer du poumon (NLST) et de l’étude européenne NELSON ont montré que le dépistage par tomodensitométrie à faible dose (LDCT) peut réduire considérablement la mortalité par cancer du poumon dans les groupes à haut risque1,2,3.Depuis l'utilisation généralisée de la TPMD pour le dépistage du cancer du poumon, l'incidence des découvertes radiographiques fortuites de nodules pulmonaires asymptomatiques a continué d'augmenter 4 .Les nodules pulmonaires sont définis comme des opacités focales atteignant 3 cm de diamètre 5 .Nous sommes confrontés à des difficultés pour évaluer la probabilité de malignité et gérer le grand nombre de nodules pulmonaires détectés accidentellement par LDCT.Les limites de la tomodensitométrie peuvent conduire à des examens de suivi fréquents et à des résultats faussement positifs, conduisant à des interventions inutiles et à un traitement excessif6.Il est donc nécessaire de développer des biomarqueurs fiables et utiles pour identifier correctement le cancer du poumon à un stade précoce et différencier la plupart des nodules bénins lors de la détection initiale 7 .
L’analyse moléculaire complète du sang (sérum, plasma, cellules mononucléées du sang périphérique), incluant la génomique, la protéomique ou la méthylation de l’ADN8,9,10, a suscité un intérêt croissant pour la découverte de biomarqueurs diagnostiques du cancer du poumon.Parallèlement, les approches métabolomique mesurent les produits cellulaires finaux qui sont influencés par des actions endogènes et exogènes et sont donc appliquées pour prédire l’apparition et l’issue de la maladie.La spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS) est une méthode largement utilisée pour les études métabolomique en raison de sa sensibilité élevée et de sa large plage dynamique, qui peut couvrir des métabolites ayant des propriétés physicochimiques différentes11,12,13.Bien que l’analyse métabolomique globale du plasma/sérum ait été utilisée pour identifier les biomarqueurs associés au diagnostic du cancer du poumon14,15,16,17 et à l’efficacité du traitement18, les classificateurs des métabolites sériques permettant de distinguer les nodules pulmonaires bénins et malins restent à étudier.-des recherches massives.
L'adénocarcinome et le carcinome épidermoïde sont les deux principaux sous-types de cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC).Divers tests de dépistage par tomodensitométrie indiquent que l'adénocarcinome est le type histologique de cancer du poumon le plus courant1,19,20,21.Dans cette étude, nous avons utilisé la spectrométrie de masse à haute résolution par chromatographie liquide ultra-performante (UPLC-HRMS) pour effectuer une analyse métabolomique sur un total de 695 échantillons de sérum, y compris des contrôles sains, des nodules pulmonaires bénins et des nodules pulmonaires ≤3 cm détectés par CT.Dépistage de l'adénocarcinome du poumon de stade I.Nous avons identifié un panel de métabolites sériques qui distinguent l'adénocarcinome du poumon des nodules bénins et des témoins sains.L'analyse d'enrichissement de la voie a révélé que le métabolisme anormal du tryptophane et du glucose est une altération courante de l'adénocarcinome du poumon par rapport aux nodules bénins et aux témoins sains.Enfin, nous avons établi et validé un classificateur métabolique sérique doté d'une spécificité et d'une sensibilité élevées pour distinguer les nodules pulmonaires malins et bénins détectés par LDCT, ce qui peut faciliter le diagnostic différentiel précoce et l'évaluation des risques.
Dans la présente étude, des échantillons de sérum correspondant au sexe et à l'âge ont été collectés rétrospectivement auprès de 174 témoins sains, 292 patients présentant des nodules pulmonaires bénins et 229 patients présentant un adénocarcinome pulmonaire de stade I.Les caractéristiques démographiques des 695 sujets sont présentées dans le tableau supplémentaire 1.
Comme le montre la figure 1a, un total de 480 échantillons de sérum, dont 174 échantillons de contrôle sain (HC), 170 nodules bénins (BN) et 136 échantillons d'adénocarcinome du poumon (LA) de stade I, ont été collectés au Sun Yat-sen University Cancer Center.Cohorte de découverte pour le profilage métabolomique non ciblé à l'aide de la chromatographie liquide ultra-performante et de la spectrométrie de masse à haute résolution (UPLC-HRMS).Comme le montre la Figure 1 supplémentaire, des métabolites différentiels entre LA et HC, LA et BN ont été identifiés afin d'établir un modèle de classification et d'explorer plus en détail l'analyse différentielle des voies.104 échantillons collectés par le Sun Yat-sen University Cancer Center et 111 échantillons collectés par deux autres hôpitaux ont été soumis respectivement à une validation interne et externe.
a Population étudiée dans la cohorte de découverte qui a subi une analyse métabolomique sérique globale à l'aide d'une chromatographie liquide ultra-performante et d'une spectrométrie de masse à haute résolution (UPLC-HRMS).b Analyse discriminante partielle des moindres carrés (PLS-DA) du métabolome total de 480 échantillons de sérum de la cohorte étudiée, y compris des témoins sains (HC, n = 174), des nodules bénins (BN, n = 170) et un adénocarcinome pulmonaire de stade I. (Los Angeles, n = 136).+ESI, mode d'ionisation par électrospray positif, -ESI, mode d'ionisation par électrospray négatif.c – e Les métabolites présentant des abondances significativement différentes dans deux groupes donnés (test de rang signé de Wilcoxon bilatéral, valeur p ajustée du taux de fausse découverte, FDR <0,05) sont représentés en rouge (changement de pli> 1,2) et en bleu (changement de pli <0,83). .) indiqué sur le graphique du volcan.f Carte thermique de regroupement hiérarchique montrant des différences significatives dans le nombre de métabolites annotés entre LA et BN.Les données sources sont fournies sous forme de fichiers de données sources.
Le métabolome sérique total de 174 HC, 170 BN et 136 LA dans le groupe découverte a été analysé par analyse UPLC-HRMS.Nous montrons d’abord que les échantillons de contrôle qualité (CQ) se regroupent étroitement au centre d’un modèle d’analyse en composantes principales (ACP) non supervisé, confirmant la stabilité des performances de l’étude actuelle (Figure 2 supplémentaire).
Comme le montre l'analyse discriminante partielle des moindres carrés (PLS-DA) sur la figure 1b, nous avons constaté qu'il existait des différences nettes entre LA et BN, LA et HC dans les modes d'ionisation par électrospray positif (+ ESI) et négatif (−ESI). .isolé.Cependant, aucune différence significative n'a été trouvée entre BN et HC dans les conditions +ESI et -ESI.
Nous avons trouvé 382 caractéristiques différentielles entre LA et HC, 231 caractéristiques différentielles entre LA et BN et 95 caractéristiques différentielles entre BN et HC (test de rang signé de Wilcoxon, FDR <0,05 et changement multiple >1,2 ou <0,83) (Figure .1c-e )..Les pics ont en outre été annotés (données supplémentaires 3) par rapport à une base de données (bibliothèque mzCloud/HMDB/Chemspider) par valeur m/z, temps de rétention et recherche par spectre de masse de fragmentation (détails décrits dans la section Méthodes) 22.Enfin, 33 et 38 métabolites annotés présentant des différences d'abondance significatives ont été identifiés pour LA par rapport au BN (Figure 1f et tableau supplémentaire 2) et LA par rapport à HC (Figure 3 supplémentaire et tableau supplémentaire 2), respectivement.En revanche, seuls 3 métabolites présentant des différences d'abondance significatives ont été identifiés dans le BN et le HC (tableau supplémentaire 2), ce qui concorde avec le chevauchement entre le BN et le HC dans le PLS-DA.Ces métabolites différentiels couvrent un large éventail de produits biochimiques (Figure 4 supplémentaire).Pris ensemble, ces résultats démontrent des changements significatifs dans le métabolome sérique qui reflètent la transformation maligne du cancer du poumon à un stade précoce par rapport aux nodules pulmonaires bénins ou aux sujets sains.Parallèlement, la similitude du métabolome sérique du BN et du HC suggère que les nodules pulmonaires bénins pourraient partager de nombreuses caractéristiques biologiques avec des individus en bonne santé.Étant donné que les mutations du gène du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) sont courantes dans le sous-type 23 de l'adénocarcinome du poumon, nous avons cherché à déterminer l'impact des mutations motrices sur le métabolome sérique.Nous avons ensuite analysé le profil métabolomique global de 72 cas présentant un statut EGFR dans le groupe adénocarcinome du poumon.Fait intéressant, nous avons trouvé des profils comparables entre les patients mutants EGFR (n = 41) et les patients EGFR de type sauvage (n = 31) dans l'analyse PCA (Figure 5a supplémentaire).Cependant, nous avons identifié 7 métabolites dont l'abondance était significativement modifiée chez les patients présentant une mutation de l'EGFR par rapport aux patients présentant une mutation de l'EGFR de type sauvage (test t, p <0,05 et changement de facteur> 1,2 ou <0,83) (Figure 5b supplémentaire).La majorité de ces métabolites (5 sur 7) sont des acylcarnitines, qui jouent un rôle important dans les voies d'oxydation des acides gras.
Comme illustré dans le flux de travail présenté à la figure 2a, les biomarqueurs pour la classification des nodules ont été obtenus à l'aide des opérateurs de retrait le moins absolu et d'une sélection basée sur 33 métabolites différentiels identifiés dans LA (n = 136) et BN (n = 170).Meilleure combinaison de variables (LASSO) – modèle de régression logistique binaire.Une validation croisée dix fois a été utilisée pour tester la fiabilité du modèle.La sélection des variables et la régularisation des paramètres sont ajustées par une pénalité de maximisation de vraisemblance avec le paramètre λ24.L'analyse métabolomique globale a ensuite été réalisée indépendamment dans les groupes de validation interne (n = 104) et de validation externe (n = 111) pour tester les performances de classification du modèle discriminant.En conséquence, 27 métabolites de l'ensemble de découverte ont été identifiés comme le meilleur modèle discriminant avec la valeur moyenne d'ASC la plus élevée (Fig. 2b), parmi lesquels 9 présentaient une activité accrue et 18 une activité diminuée dans LA par rapport au BN (Fig. 2c).
Flux de travail pour la création d'un classificateur de nodules pulmonaires, comprenant la sélection du meilleur panel de métabolites sériques dans l'ensemble de découverte à l'aide d'un modèle de régression logistique binaire via une validation croisée dix fois et l'évaluation des performances prédictives dans des ensembles de validation internes et externes.b Statistiques de validation croisée du modèle de régression LASSO pour la sélection de biomarqueurs métaboliques.Les chiffres donnés ci-dessus représentent le nombre moyen de biomarqueurs sélectionnés à un λ donné.La ligne pointillée rouge représente la valeur moyenne de l'AUC au lambda correspondant.Les barres d'erreur grises représentent les valeurs minimales et maximales de l'AUC.La ligne pointillée indique le meilleur modèle avec les 27 biomarqueurs sélectionnés.AUC, aire sous la courbe des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC).c Modifications multiples de 27 métabolites sélectionnés dans le groupe LA par rapport au groupe BN dans le groupe découverte.Colonne rouge – activation.La colonne bleue représente une baisse.d – f Courbes des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) montrant la puissance du modèle discriminant basé sur 27 combinaisons de métabolites dans les ensembles de découverte, de validation interne et externe.Les données sources sont fournies sous forme de fichiers de données sources.
Un modèle de prédiction a été créé sur la base des coefficients de régression pondérés de ces 27 métabolites (tableau supplémentaire 3).L'analyse ROC basée sur ces 27 métabolites a donné une valeur d'aire sous la courbe (AUC) de 0, 933, la sensibilité du groupe de découverte était de 0, 868 et la spécificité était de 0, 859 (Fig. 2d).Pendant ce temps, parmi les 38 métabolites différentiels annotés entre LA et HC, un ensemble de 16 métabolites a atteint une AUC de 0,902 avec une sensibilité de 0,801 et une spécificité de 0,856 pour distinguer LA de HC (Figure 6a-c supplémentaire).Les valeurs d'ASC basées sur différents seuils de changement de facteur pour les métabolites différentiels ont également été comparées.Nous avons constaté que le modèle de classification fonctionnait mieux pour distinguer LA et BN (HC) lorsque le niveau de changement de pli était fixé à 1,2 contre 1,5 ou 2,0 (Figure supplémentaire 7a, b).Le modèle de classification, basé sur 27 groupes de métabolites, a été validé dans des cohortes internes et externes.L'ASC était de 0,915 (sensibilité 0,867, spécificité 0,811) pour la validation interne et de 0,945 (sensibilité 0,810, spécificité 0,979) pour la validation externe (Fig. 2e, f).Pour évaluer l'efficacité interlaboratoire, 40 échantillons de la cohorte externe ont été analysés dans un laboratoire externe comme décrit dans la section Méthodes.La précision de la classification a atteint une AUC de 0,925 (Figure 8 supplémentaire).Étant donné que le carcinome épidermoïde du poumon (LUSC) est le deuxième sous-type le plus courant de cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) après l'adénocarcinome du poumon (LUAD), nous avons également testé l'utilité potentielle validée des profils métaboliques.BN et 16 cas de LUSC.L'AUC de discrimination entre LUSC et BN était de 0, 776 (Figure 9 supplémentaire), ce qui indique une capacité inférieure par rapport à la discrimination entre LUAD et BN.
Des études ont montré que la taille des nodules sur les images CT est positivement corrélée à la probabilité de malignité et reste un déterminant majeur du traitement des nodules25,26,27.L'analyse des données de la grande cohorte de l'étude de dépistage NELSON a montré que le risque de tumeur maligne chez les sujets présentant des ganglions <5 mm était même similaire à celui des sujets sans ganglions 28 .Par conséquent, la taille minimale nécessitant une surveillance tomodensitométrique régulière est de 5 mm, comme le recommande la British Thoracic Society (BTS), et de 6 mm, comme le recommande la Fleischner Society 29 .Cependant, les nodules de plus de 6 mm et sans caractéristiques bénignes évidentes, appelés nodules pulmonaires indéterminés (IPN), restent un défi majeur en matière d'évaluation et de prise en charge en pratique clinique30,31.Nous avons ensuite examiné si la taille des nodules influençait les signatures métabolomiques en utilisant des échantillons regroupés provenant des cohortes de découverte et de validation interne.En nous concentrant sur 27 biomarqueurs validés, nous avons d'abord comparé les profils PCA des métabolomes HC et BN inférieurs à 6 mm.Nous avons constaté que la plupart des points de données pour HC et BN se chevauchaient, démontrant que les taux de métabolites sériques étaient similaires dans les deux groupes (Fig. 3a).Les cartes caractéristiques dans différentes plages de tailles sont restées conservées dans BN et LA (Fig. 3b, c), alors qu'une séparation a été observée entre les nodules malins et bénins dans la plage de 6 à 20 mm (Fig. 3d).Cette cohorte avait une ASC de 0,927, une spécificité de 0,868 et une sensibilité de 0,820 pour prédire la malignité des nodules mesurant 6 à 20 mm (Fig. 3e, f).Nos résultats montrent que le classificateur peut capturer les changements métaboliques provoqués par une transformation maligne précoce, quelle que soit la taille du nodule.
ad Comparaison des profils PCA entre des groupes spécifiés sur la base d'un classificateur métabolique de 27 métabolites.CC et BN < 6 mm.b BN < 6 mm contre BN 6 à 20 mm.dans LA 6–20 mm contre LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm et LA 6–20 mm.CG, n = 174 ;BN < 6 mm, n = 153 ;BN 6 à 20 mm, n = 91 ;LA 6–20 mm, n = 89 ;LA 20–30 mm, n = 77. e Courbe des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) montrant les performances discriminantes du modèle pour les nodules de 6–20 mm.f Les valeurs de probabilité ont été calculées sur la base du modèle de régression logistique pour les nodules mesurant 6 à 20 mm.La ligne pointillée grise représente la valeur seuil optimale (0,455).Les chiffres ci-dessus représentent le pourcentage de cas projetés pour Los Angeles.Utilisez un test t de Student bilatéral.ACP, analyse en composantes principales.Aire AUC sous la courbe.Les données sources sont fournies sous forme de fichiers de données sources.
Quatre échantillons (âgés de 44 à 61 ans) présentant des tailles de nodules pulmonaires similaires (7 à 9 mm) ont ensuite été sélectionnés pour illustrer les performances du modèle de prédiction de malignité proposé (Fig. 4a, b).Lors du dépistage initial, le cas 1 s'est présenté comme un nodule solide avec calcification, une caractéristique associée à la bénignité, tandis que le cas 2 s'est présenté comme un nodule indéterminé partiellement solide sans caractéristiques bénignes évidentes.Trois séries de tomodensitogrammes de suivi ont montré que ces cas restaient stables sur une période de 4 ans et étaient donc considérés comme des nodules bénins (Fig. 4a).Par rapport à l'évaluation clinique de tomodensitogrammes en série, l'analyse des métabolites sériques en une seule fois avec le modèle de classificateur actuel a rapidement et correctement identifié ces nodules bénins sur la base de contraintes probabilistes (Tableau 1).La figure 4b dans le cas 3 montre un nodule présentant des signes de rétraction pleurale, le plus souvent associé à une tumeur maligne32.Cas 4 présenté comme un nodule indéterminé partiellement solide sans preuve de cause bénigne.Tous ces cas étaient prédits comme malins selon le modèle classificateur (Tableau 1).L'évaluation de l'adénocarcinome du poumon a été démontrée par un examen histopathologique après une chirurgie de résection pulmonaire (Fig. 4b).Pour l'ensemble de validation externe, le classificateur métabolique a prédit avec précision deux cas de nodules pulmonaires indéterminés de taille supérieure à 6 mm (Figure 10 supplémentaire).
Images tomodensitométriques de la fenêtre axiale des poumons de deux cas de nodules bénins.Dans le cas 1, le scanner à 4 ans a montré un nodule solide stable mesurant 7 mm avec calcification du lobe inférieur droit.Dans le cas 2, le scanner à 5 ans a révélé un nodule stable, partiellement solide, d'un diamètre de 7 mm dans le lobe supérieur droit.b Images tomodensitométriques en fenêtre axiale des poumons et études pathologiques correspondantes de deux cas d'adénocarcinome de stade I avant résection pulmonaire.Le cas 3 révélait un nodule de 8 mm de diamètre au niveau du lobe supérieur droit avec rétraction pleurale.Le cas 4 a révélé un nodule en verre dépoli partiellement solide mesurant 9 mm dans le lobe supérieur gauche.Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) du tissu pulmonaire réséqué (barre d'échelle = 50 μm) démontrant le schéma de croissance acineux de l'adénocarcinome du poumon.Les flèches indiquent les nodules détectés sur les images CT.Les images H&E sont des images représentatives de plusieurs (> 3) champs microscopiques examinés par le pathologiste.
Pris ensemble, nos résultats démontrent la valeur potentielle des biomarqueurs des métabolites sériques dans le diagnostic différentiel des nodules pulmonaires, ce qui peut poser des défis lors de l'évaluation du dépistage par tomodensitométrie.
Sur la base d'un panel de métabolites différentiels validés, nous avons cherché à identifier les corrélats biologiques des changements métaboliques majeurs.L'analyse d'enrichissement de la voie KEGG par MetaboAnalyst a identifié 6 voies communes significativement modifiées entre les deux groupes donnés (LA contre HC et LA contre BN, p ajusté ≤ 0,001, effet > 0,01).Ces changements ont été caractérisés par des perturbations du métabolisme du pyruvate, du métabolisme du tryptophane, du métabolisme de la niacine et du nicotinamide, de la glycolyse, du cycle du TCA et du métabolisme des purines (Fig. 5a).Nous avons ensuite effectué une métabolomique ciblée pour vérifier les changements majeurs à l'aide d'une quantification absolue.Détermination des métabolites communs dans les voies couramment modifiées par spectrométrie de masse triple quadripôle (QQQ) à l'aide d'étalons de métabolites authentiques.Les caractéristiques démographiques de l'échantillon cible de l'étude métabolomique sont incluses dans le tableau supplémentaire 4. Conformément à nos résultats métabolomique globaux, l'analyse quantitative a confirmé que l'hypoxanthine et la xanthine, le pyruvate et le lactate étaient augmentés dans LA par rapport au BN et au HC (Fig. 5b, c, p <0,05).Cependant, aucune différence significative dans ces métabolites n’a été constatée entre le BN et le HC.
Analyse d'enrichissement de la voie KEGG de métabolites significativement différents dans le groupe LA par rapport aux groupes BN et HC.Un Globaltest bilatéral a été utilisé et les valeurs p ont été ajustées à l'aide de la méthode Holm-Bonferroni (p ajusté ≤ 0,001 et taille de l'effet > 0,01).b – d Graphiques Violin montrant les taux d'hypoxanthine, de xanthine, de lactate, de pyruvate et de tryptophane dans les sérums HC, BN et LA déterminés par LC-MS/MS (n = 70 par groupe).Les lignes pointillées blanches et noires indiquent respectivement la médiane et le quartile.e Graphique Violin montrant l'expression normalisée de l'ARNm Log2TPM (transcriptions par million) de SLC7A5 et QPRT dans l'adénocarcinome du poumon (n = 513) par rapport au tissu pulmonaire normal (n = 59) dans l'ensemble de données LUAD-TCGA.La case blanche représente l'intervalle interquartile, la ligne noire horizontale au centre représente la médiane et la ligne noire verticale s'étendant à partir de la case représente l'intervalle de confiance (IC) à 95 %.f Graphique de corrélation de Pearson de l'expression de SLC7A5 et GAPDH dans l'adénocarcinome du poumon (n = 513) et le tissu pulmonaire normal (n = 59) dans l'ensemble de données TCGA.La zone grise représente l'IC à 95 %.r, coefficient de corrélation de Pearson.g Niveaux de tryptophane cellulaire normalisés dans les cellules A549 transfectées avec un contrôle shRNA non spécifique (NC) et shSLC7A5 (Sh1, Sh2) déterminés par LC-MS/MS.L'analyse statistique de cinq échantillons biologiquement indépendants dans chaque groupe est présentée.h Niveaux cellulaires de NADt (NAD total, y compris NAD+ et NADH) dans les cellules A549 (NC) et les cellules A549 knockdown SLC7A5 (Sh1, Sh2).L'analyse statistique de trois échantillons biologiquement indépendants dans chaque groupe est présentée.i L'activité glycolytique des cellules A549 avant et après l'inactivation de SLC7A5 a été mesurée par le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) (n = 4 échantillons biologiquement indépendants par groupe).2-DG,2-désoxy-D-glucose.Le test t bilatéral de Student a été utilisé dans (b – h).Dans (g – i), les barres d'erreur représentent la moyenne ± SD, chaque expérience a été réalisée trois fois indépendamment et les résultats étaient similaires.Les données sources sont fournies sous forme de fichiers de données sources.
Compte tenu de l’impact significatif de l’altération du métabolisme du tryptophane dans le groupe LA, nous avons également évalué les taux sériques de tryptophane dans les groupes HC, BN et LA à l’aide de QQQ.Nous avons constaté que le tryptophane sérique était réduit dans LA par rapport à HC ou BN (p < 0,001, Figure 5d), ce qui concorde avec les découvertes précédentes selon lesquelles les taux de tryptophane circulant sont plus faibles chez les patients atteints d'un cancer du poumon que chez les témoins sains du groupe témoin. ,35.Une autre étude utilisant le traceur TEP/CT 11C-méthyl-L-tryptophane a révélé que le temps de rétention du signal du tryptophane dans les tissus cancéreux du poumon était significativement augmenté par rapport aux lésions bénignes ou aux tissus normaux36.Nous émettons l'hypothèse que la diminution du tryptophane dans le sérum LA pourrait refléter une absorption active du tryptophane par les cellules cancéreuses du poumon.
On sait également que le produit final de la voie kynurénine du catabolisme du tryptophane est le NAD+37,38, qui est un substrat important pour la réaction du glycéraldéhyde-3-phosphate avec le 1,3-bisphosphoglycérate dans la glycolyse39.Alors que des études antérieures se sont concentrées sur le rôle du catabolisme du tryptophane dans la régulation immunitaire, nous avons cherché à élucider l'interaction entre la dérégulation du tryptophane et les voies glycolytiques observées dans la présente étude.Le membre 5 de la famille 7 des transporteurs de solutés (SLC7A5) est connu pour être un transporteur de tryptophane43,44,45.L'acide quinolinique phosphoribosyltransférase (QPRT) est une enzyme située en aval de la voie de la kynurénine qui convertit l'acide quinolinique en NAMN46.L'inspection de l'ensemble de données LUAD TCGA a révélé que SLC7A5 et QPRT étaient significativement régulés positivement dans le tissu tumoral par rapport au tissu normal (Fig. 5e).Cette augmentation a été observée aux stades I et II ainsi qu'aux stades III et IV de l'adénocarcinome du poumon (Figure 11 supplémentaire), indiquant des perturbations précoces du métabolisme du tryptophane associées à la tumorigenèse.
De plus, l'ensemble de données LUAD-TCGA a montré une corrélation positive entre l'expression de l'ARNm de SLC7A5 et de GAPDH dans des échantillons de patients atteints de cancer (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figure 5f).En revanche, aucune corrélation significative n'a été trouvée entre ces signatures génétiques dans le tissu pulmonaire normal (r = 0,25, p = 0,06, Figure 5f).L'inactivation de SLC7A5 (Figure 12 supplémentaire) dans les cellules A549 a réduit de manière significative les niveaux cellulaires de tryptophane et de NAD (H) (Figure 5g, h), entraînant une activité glycolytique atténuée mesurée par le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) (Figure 1).5i).Ainsi, sur la base des modifications métaboliques dans le sérum et de la détection in vitro, nous émettons l’hypothèse que le métabolisme du tryptophane pourrait produire du NAD+ via la voie de la kynurénine et jouer un rôle important dans la promotion de la glycolyse dans le cancer du poumon.
Des études ont montré qu'un grand nombre de nodules pulmonaires indéterminés détectés par LDCT peuvent nécessiter des tests supplémentaires tels que la TEP-TDM, la biopsie pulmonaire et un traitement excessif en raison d'un diagnostic faussement positif de malignité.31 Comme le montre la figure 6, notre étude a identifié un panel de métabolites sériques ayant une valeur diagnostique potentielle susceptible d'améliorer la stratification du risque et la gestion ultérieure des nodules pulmonaires détectés par tomodensitométrie.
Les nodules pulmonaires sont évalués par tomodensitométrie à faible dose (LDCT) avec des caractéristiques d'imagerie évocatrices de causes bénignes ou malignes.L'issue incertaine des nodules peut entraîner des visites de suivi fréquentes, des interventions inutiles et un traitement excessif.L'inclusion de classificateurs métaboliques sériques ayant une valeur diagnostique peut améliorer l'évaluation des risques et la prise en charge ultérieure des nodules pulmonaires.Tomographie par émission de positons TEP.
Les données de l'étude américaine NLST et de l'étude européenne NELSON suggèrent que le dépistage des groupes à haut risque par tomodensitométrie à faible dose (LDCT) pourrait réduire la mortalité par cancer du poumon1,3.Cependant, l'évaluation des risques et la prise en charge clinique ultérieure d'un grand nombre de nodules pulmonaires fortuits détectés par LDCT restent les plus difficiles.L'objectif principal est d'optimiser la classification correcte des protocoles existants basés sur la TPMD en incorporant des biomarqueurs fiables.
Certains biomarqueurs moléculaires, tels que les métabolites sanguins, ont été identifiés en comparant le cancer du poumon à des témoins sains15,17.Dans la présente étude, nous nous sommes concentrés sur l’application de l’analyse métabolomique sérique pour distinguer les nodules pulmonaires bénins et malins détectés accidentellement par LDCT.Nous avons comparé le métabolome sérique global d'échantillons de contrôle sain (HC), de nodules pulmonaires bénins (BN) et d'adénocarcinome du poumon (LA) de stade I à l'aide de l'analyse UPLC-HRMS.Nous avons constaté que HC et BN avaient des profils métaboliques similaires, alors que LA présentait des changements significatifs par rapport à HC et BN.Nous avons identifié deux ensembles de métabolites sériques qui différencient le LA du HC et du BN.
Le système actuel d'identification des nodules bénins et malins, basé sur la TPMD, repose principalement sur la taille, la densité, la morphologie et le taux de croissance des nodules au fil du temps30.Des études antérieures ont montré que la taille des nodules est étroitement liée au risque de cancer du poumon.Même chez les patients à haut risque, le risque de tumeur maligne dans les ganglions <6 mm est <1 %.Le risque de malignité pour les nodules mesurant 6 à 20 mm varie de 8 % à 64 %30.Par conséquent, la Fleischner Society recommande un diamètre de coupure de 6 mm pour le suivi de routine par tomodensitométrie.29 Cependant, l'évaluation des risques et la prise en charge des nodules pulmonaires indéterminés (IPN) de plus de 6 mm n'ont pas été réalisées de manière adéquate 31 .La prise en charge actuelle des cardiopathies congénitales repose généralement sur une attente vigilante avec une surveillance tomodensitométrique fréquente.
Sur la base du métabolome validé, nous avons démontré pour la première fois le chevauchement des signatures métabolomiques entre individus sains et nodules bénins <6 mm.La similarité biologique est cohérente avec les résultats de tomodensitométrie précédents selon lesquels le risque de malignité pour les nodules <6 mm est aussi faible que pour les sujets sans ganglions.30 Il convient de noter que nos résultats démontrent également que les nodules bénins <6 mm et ≥6 mm ont un risque élevé. similarité dans les profils métabolomiques, ce qui suggère que la définition fonctionnelle de l'étiologie bénigne est cohérente quelle que soit la taille du nodule.Ainsi, les panels diagnostiques modernes de métabolites sériques peuvent fournir un test unique comme test d’exclusion lorsque des nodules sont initialement détectés par tomodensitométrie et potentiellement réduire la surveillance en série.Dans le même temps, le même panel de biomarqueurs métaboliques distinguait les nodules malins de taille ≥6 mm des nodules bénins et fournissait des prédictions précises pour les IPN de taille similaire et de caractéristiques morphologiques ambiguës sur les images CT.Ce classificateur du métabolisme sérique a bien fonctionné pour prédire la malignité des nodules ≥ 6 mm avec une ASC de 0,927.Pris ensemble, nos résultats indiquent que des signatures métabolomiques sériques uniques peuvent refléter spécifiquement les changements métaboliques précoces induits par la tumeur et avoir une valeur potentielle en tant que prédicteurs de risque, indépendamment de la taille des nodules.
Notamment, l'adénocarcinome du poumon (LUAD) et le carcinome épidermoïde (LUSC) sont les principaux types de cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC).Étant donné que LUSC est fortement associé au tabagisme47 et que LUAD est l'histologie la plus courante de nodules pulmonaires accidentels détectés lors du dépistage par tomodensitométrie48, notre modèle de classificateur a été spécifiquement conçu pour les échantillons d'adénocarcinome de stade I.Wang et ses collègues se sont également concentrés sur LUAD et ont identifié neuf signatures lipidiques en utilisant la lipidomique pour distinguer le cancer du poumon à un stade précoce des individus en bonne santé17.Nous avons testé le modèle de classificateur actuel sur 16 cas de LUSC de stade I et 74 nodules bénins et avons observé une faible précision de prédiction de LUSC (AUC 0,776), ce qui suggère que LUAD et LUSC pourraient avoir leurs propres signatures métabolomiques.En effet, il a été démontré que LUAD et LUSC diffèrent par leur étiologie, leur origine biologique et leurs aberrations génétiques49.Par conséquent, d’autres types d’histologie devraient être inclus dans les modèles de formation pour la détection du cancer du poumon dans la population dans les programmes de dépistage.
Ici, nous avons identifié les six voies les plus fréquemment altérées dans l'adénocarcinome du poumon par rapport aux témoins sains et aux nodules bénins.La xanthine et l'hypoxanthine sont des métabolites courants de la voie métabolique des purines.Conformément à nos résultats, les intermédiaires associés au métabolisme des purines étaient significativement augmentés dans le sérum ou les tissus des patients atteints d'adénocarcinome du poumon par rapport aux témoins sains ou aux patients au stade pré-invasif15,50.Des taux sériques élevés de xanthine et d’hypoxanthine peuvent refléter l’anabolisme requis par les cellules cancéreuses à prolifération rapide.La dérégulation du métabolisme du glucose est une caractéristique bien connue du métabolisme du cancer51.Ici, nous avons observé une augmentation significative du pyruvate et du lactate dans le groupe LA par rapport aux groupes HC et BN, ce qui concorde avec les rapports antérieurs faisant état d'anomalies de la voie glycolytique dans les profils du métabolome sérique de patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) et contrôles sains.les résultats sont cohérents52,53.
Il est important de noter que nous avons observé une corrélation inverse entre le métabolisme du pyruvate et du tryptophane dans le sérum des adénocarcinomes du poumon.Les taux sériques de tryptophane étaient réduits dans le groupe LA par rapport au groupe HC ou BN.Il est intéressant de noter qu'une précédente étude à grande échelle utilisant une cohorte prospective a révélé que de faibles niveaux de tryptophane circulant étaient associés à un risque accru de cancer du poumon 54 .Le tryptophane est un acide aminé essentiel que nous obtenons entièrement de l’alimentation.Nous concluons que la déplétion sérique en tryptophane dans l'adénocarcinome du poumon peut refléter une déplétion rapide de ce métabolite.Il est bien connu que le produit final du catabolisme du tryptophane via la voie de la kynurénine est la source de la synthèse de novo de NAD+.Étant donné que le NAD+ est produit principalement par la voie de récupération, son importance dans le métabolisme du tryptophane dans la santé et la maladie reste à déterminer46.Notre analyse de la base de données TCGA a montré que l'expression du transporteur de soluté du transporteur de tryptophane 7A5 (SLC7A5) était significativement augmentée dans l'adénocarcinome du poumon par rapport aux témoins normaux et était positivement corrélée à l'expression de l'enzyme glycolytique GAPDH.Des études antérieures se sont principalement concentrées sur le rôle du catabolisme du tryptophane dans la suppression de la réponse immunitaire antitumorale40,41,42.Nous démontrons ici que l'inhibition de l'absorption du tryptophane par l'inactivation de SLC7A5 dans les cellules cancéreuses du poumon entraîne une diminution ultérieure des niveaux cellulaires de NAD et une atténuation concomitante de l'activité glycolytique.En résumé, notre étude fournit une base biologique aux modifications du métabolisme sérique associées à la transformation maligne de l'adénocarcinome du poumon.
Les mutations de l'EGFR sont les mutations motrices les plus courantes chez les patients atteints de CPNPC.Dans notre étude, nous avons constaté que les patients présentant une mutation EGFR (n = 41) présentaient des profils métabolomiques globaux similaires à ceux des patients présentant une mutation EGFR de type sauvage (n = 31), bien que nous ayons constaté une diminution des taux sériques de certains patients mutants EGFR chez les patients atteints d'acylcarnitine.La fonction établie des acylcarnitines est de transporter les groupes acyle du cytoplasme vers la matrice mitochondriale, conduisant à l'oxydation des acides gras pour produire de l'énergie 55 .Conformément à nos résultats, une étude récente a également identifié des profils de métabolome similaires entre les tumeurs mutantes EGFR et les tumeurs de type sauvage EGFR en analysant le métabolome global de 102 échantillons de tissus d'adénocarcinome du poumon50.Il est intéressant de noter que la teneur en acylcarnitine a également été trouvée dans le groupe mutant EGFR.Par conséquent, la question de savoir si les modifications des taux d’acylcarnitine reflètent les modifications métaboliques induites par l’EGFR et les voies moléculaires sous-jacentes pourrait mériter une étude plus approfondie.
En conclusion, notre étude établit un classificateur métabolique sérique pour le diagnostic différentiel des nodules pulmonaires et propose un flux de travail qui peut optimiser l'évaluation des risques et faciliter la prise en charge clinique basée sur le dépistage par tomodensitométrie.
Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique de l'hôpital universitaire de cancérologie Sun Yat-sen, le premier hôpital affilié de l'université Sun Yat-sen et le comité d'éthique de l'hôpital universitaire de cancérologie de Zhengzhou.Dans les groupes de découverte et de validation interne, 174 sérums d'individus sains et 244 sérums de nodules bénins ont été collectés auprès d'individus subissant des examens médicaux annuels au Département de contrôle et de prévention du cancer du Centre de lutte contre le cancer de l'Université Sun Yat-sen, ainsi que 166 nodules bénins.sérum.Des adénocarcinomes pulmonaires de stade I ont été collectés au centre de cancérologie de l'université Sun Yat-sen.Dans la cohorte de validation externe, il y avait 48 cas de nodules bénins, 39 cas d'adénocarcinome du poumon de stade I du premier hôpital affilié de l'université Sun Yat-sen et 24 cas d'adénocarcinome du poumon de stade I de l'hôpital du cancer de Zhengzhou.Le centre de lutte contre le cancer de l'université Sun Yat-sen a également collecté 16 cas de cancer épidermoïde du poumon de stade I pour tester la capacité diagnostique du classificateur métabolique établi (les caractéristiques des patients sont présentées dans le tableau supplémentaire 5).Des échantillons de la cohorte de découverte et de la cohorte de validation interne ont été collectés entre janvier 2018 et mai 2020. Des échantillons de la cohorte de validation externe ont été collectés entre août 2021 et octobre 2022. Pour minimiser les préjugés sexistes, des nombres à peu près égaux de cas masculins et féminins ont été attribués à chacun. cohorte.Équipe de découverte et équipe de révision interne.Le sexe des participants a été déterminé sur la base de leur auto-évaluation.Le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants et aucune compensation n'a été versée.Les sujets présentant des nodules bénins étaient ceux ayant un score tomodensitométrique stable entre 2 et 5 ans au moment de l'analyse, à l'exception d'un cas de l'échantillon de validation externe, qui a été collecté en préopératoire et diagnostiqué par histopathologie.À l'exception de la bronchite chronique.Les cas d'adénocarcinome du poumon ont été collectés avant la résection pulmonaire et confirmés par un diagnostic pathologique.Des échantillons de sang à jeun ont été prélevés dans des tubes de séparation de sérum sans aucun anticoagulant.Les échantillons de sang ont été coagulés pendant 1 heure à température ambiante, puis centrifugés à 2 851 × g pendant 10 minutes à 4 °C pour recueillir le surnageant de sérum.Les aliquotes de sérum ont été congelées à -80°C jusqu'à l'extraction des métabolites.Le Département de prévention du cancer et d'examen médical du Centre de cancérologie de l'Université Sun Yat-sen a collecté un pool de sérum provenant de 100 donneurs sains, dont un nombre égal d'hommes et de femmes âgés de 40 à 55 ans.Des volumes égaux de chaque échantillon de donneur ont été mélangés, le pool résultant a été aliquoté et stocké à -80°C.Le mélange de sérum a été utilisé comme matériau de référence pour le contrôle qualité et la standardisation des données.
Le sérum de référence et les échantillons de test ont été décongelés et les métabolites ont été extraits à l'aide d'une méthode d'extraction combinée (MTBE/méthanol/eau) 56 .En bref, 50 µl de sérum ont été mélangés avec 225 µl de méthanol glacé et 750 µl d'éther méthyltert-butylique (MTBE) glacé.Remuer le mélange et incuber sur la glace pendant 1 heure.Les échantillons ont ensuite été mélangés et mélangés au vortex avec 188 µl d'eau de qualité MS contenant des étalons internes (lactate 13C, pyruvate 13C3, méthionine 13C et isoleucine 13C6, achetés auprès de Cambridge Isotope Laboratories).Le mélange a ensuite été centrifugé à 15 000 × g pendant 10 min à 4 ° C et la phase inférieure a été transférée dans deux tubes (125 μL chacun) pour une analyse LC-MS en modes positif et négatif.Enfin, l’échantillon a été évaporé à sec dans un concentrateur sous vide à grande vitesse.
Les métabolites séchés ont été reconstitués dans 120 µl d'acétonitrile à 80 %, vortexés pendant 5 min et centrifugés à 15 000 × g pendant 10 min à 4°C.Les surnageants ont été transférés dans des flacons en verre ambré avec des microinserts pour des études métabolomiques.Analyse métabolomique non ciblée sur une plateforme de chromatographie liquide ultra-performante et de spectrométrie de masse à haute résolution (UPLC-HRMS).Les métabolites ont été séparés à l'aide d'un système Dionex Ultimate 3000 UPLC et d'une colonne ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).En mode ions positifs, les phases mobiles étaient constituées de 95 % (A) et 50 % d'acétonitrile (B), chacune contenant 10 mmol/L d'acétate d'ammonium et 0,1 % d'acide formique.En mode négatif, les phases mobiles A et B contenaient respectivement 95 % et 50 % d'acétonitrile, les deux phases contenaient 10 mmol/L d'acétate d'ammonium, pH = 9. Le programme de gradient était le suivant : 0 à 0,5 min, 2 % de B ;0,5 à 12 minutes, 2 à 50 % de B ;12 à 14 minutes, 50 à 98 % de B ;14 à 16 minutes, 98 % B ;16-16.1.min, 98 –2 % B ;16,1 à 20 min, 2 % de B. La colonne a été maintenue à 40 °C et l'échantillon à 10 °C dans l'échantillonneur automatique.Le débit était de 0,3 ml/min, le volume d'injection était de 3 µl.Un spectromètre de masse Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) doté d'une source d'ionisation par électrospray (ESI) a été utilisé en mode balayage complet et couplé au mode de surveillance ddMS2 pour collecter de grands volumes de données.Les paramètres MS ont été réglés comme suit : tension de pulvérisation +3,8 kV/- 3,2 kV, température capillaire 320°C, gaz de protection 40 arb, gaz auxiliaire 10 arb, température du chauffage de la sonde 350°C, plage de balayage 70-1050 m/h, résolution.70 000. Les données ont été acquises à l'aide de Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Pour évaluer la qualité des données, des échantillons regroupés de contrôle de qualité (CQ) ont été générés en retirant des aliquotes de 10 μL du surnageant de chaque échantillon.Six injections d’échantillons de contrôle qualité ont été analysées au début de la séquence analytique pour évaluer la stabilité du système UPLC-MS.Des échantillons de contrôle qualité sont ensuite introduits périodiquement dans le lot.Les 11 lots d'échantillons de sérum de cette étude ont été analysés par LC-MS.Des aliquotes d'un mélange de sérum provenant de 100 donneurs sains ont été utilisées comme matériau de référence dans les lots respectifs pour surveiller le processus d'extraction et ajuster les effets d'un lot à l'autre.Une analyse métabolomique non ciblée de la cohorte de découverte, de la cohorte de validation interne et de la cohorte de validation externe a été réalisée au centre de métabolomique de l'université Sun Yat-sen.Le laboratoire externe du Centre d'analyse et de test de l'Université de technologie du Guangdong a également analysé 40 échantillons de la cohorte externe pour tester les performances du modèle de classificateur.
Après extraction et reconstitution, la quantification absolue des métabolites sériques a été mesurée à l'aide d'une spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide à ultra haute performance (Agilent 6495 triple quadripôle) avec une source d'ionisation par électrospray (ESI) en mode de surveillance de réactions multiples (MRM).Une colonne ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) a été utilisée pour séparer les métabolites.La phase mobile était constituée de 90 % (A) et 5 % d’acétonitrile (B) avec 10 mmol/L d’acétate d’ammonium et 0,1 % de solution d’ammoniaque.Le programme de gradient était le suivant : 0 à 1,5 min, 0 % de B ;1,5 à 6,5 minutes, 0 à 15 % de B ;6,5 à 8 minutes, 15 % de B ;8 à 8,5 minutes, 15 % à 0 % B ;8,5 à 11,5 minutes, 0 %B.La colonne a été maintenue à 40 °C et l'échantillon à 10 °C dans l'échantillonneur automatique.Le débit était de 0,3 mL/min et le volume d’injection était de 1 µL.Les paramètres MS ont été définis comme suit : tension capillaire ± 3,5 kV, pression du nébuliseur 35 psi, débit de gaz de gaine 12 L/min, température du gaz de gaine 350 °C, température du gaz de séchage 250 °C et débit de gaz de séchage 14 l/min.Les conversions MRM du tryptophane, du pyruvate, du lactate, de l'hypoxanthine et de la xanthine étaient de 205,0 à 187,9, de 87,0 à 43,4, de 89,0 à 43,3, de 135,0 à 92,3 et de 151,0 à 107.9 respectivement.Les données ont été collectées à l'aide de Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Pour les échantillons de sérum, le tryptophane, le pyruvate, le lactate, l'hypoxanthine et la xanthine ont été quantifiés à l'aide de courbes d'étalonnage de solutions de mélange étalon.Pour les échantillons de cellules, la teneur en tryptophane a été normalisée par rapport à l'étalon interne et à la masse protéique cellulaire.
L'extraction des pics (m/z et temps de rétention (RT)) a été réalisée à l'aide de Compound Discovery 3.1 et TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Pour éliminer les différences potentielles entre les lots, chaque pic caractéristique de l'échantillon testé a été divisé par le pic caractéristique du matériau de référence du même lot pour obtenir l'abondance relative.Les écarts types relatifs des étalons internes avant et après la standardisation sont présentés dans le tableau supplémentaire 6. Les différences entre les deux groupes ont été caractérisées par un taux de fausses découvertes (FDR <0, 05, test de rang signé de Wilcoxon) et un changement de pli (> 1, 2 ou <0, 83).Les données MS brutes des caractéristiques extraites et les données MS de référence corrigées par le sérum sont présentées respectivement dans les données supplémentaires 1 et les données supplémentaires 2.L'annotation des pics a été réalisée sur la base de quatre niveaux d'identification définis, y compris les métabolites identifiés, les composés putativement annotés, les classes de composés putativement caractérisées et les composés inconnus 22 .Sur la base de recherches dans la base de données Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), des composés biologiques avec MS/MS correspondant aux normes validées ou des annotations de correspondance exacte dans mzCloud (score > 85) ou Chemspider ont finalement été sélectionnés comme intermédiaires entre le métabolome différentiel.Les annotations de pic pour chaque caractéristique sont incluses dans les données supplémentaires 3. MetaboAnalyst 5.0 a été utilisé pour une analyse univariée de l'abondance des métabolites normalisée en somme.MetaboAnalyst 5.0 a également évalué l'analyse d'enrichissement de la voie KEGG basée sur des métabolites significativement différents.L'analyse en composantes principales (ACP) et l'analyse discriminante des moindres carrés partiels (PLS-DA) ont été analysées à l'aide du progiciel ropls (v.1.26.4) avec normalisation de la pile et mise à l'échelle automatique.Le modèle de biomarqueur métabolite optimal pour prédire la malignité des nodules a été généré à l'aide d'une régression logistique binaire avec le moindre opérateur de retrait absolu et de sélection (LASSO, package R v.4.1-3).Les performances du modèle discriminant dans les ensembles de détection et de validation ont été caractérisées par l'estimation de l'AUC basée sur l'analyse ROC selon le package pROC (v.1.18.0.).Le seuil de probabilité optimal a été obtenu sur la base de l’indice de Youden maximum du modèle (sensibilité + spécificité – 1).Les échantillons avec des valeurs inférieures ou supérieures au seuil seront respectivement prédits comme nodules bénins et adénocarcinome du poumon.
Les cellules A549 (# CCL-185, American Type Culture Collection) ont été cultivées dans un milieu F-12K contenant 10 % de FBS.Des séquences d'ARN en épingle à cheveux courtes (shRNA) ciblant SLC7A5 et un contrôle non ciblant (NC) ont été insérées dans le vecteur lentiviral pLKO.1-puro.Les séquences antisens de shSLC7A5 sont les suivantes : Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Les anticorps anti-SLC7A5 (n° 5347) et tubuline (n° 2148) ont été achetés auprès de Cell Signaling Technology.Les anticorps anti-SLC7A5 et tubuline ont été utilisés à une dilution de 1: 1 000 pour l'analyse par Western blot.
Le test de stress glycolytique Seahorse XF mesure les niveaux d’acidification extracellulaire (ECAR).Dans le test, le glucose, l'oligomycine A et le 2-DG ont été administrés séquentiellement pour tester la capacité glycolytique cellulaire mesurée par ECAR.
Les cellules A549 transfectées avec un contrôle non ciblage (NC) et shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ont été étalées pendant une nuit dans des boîtes de 10 cm de diamètre.Les métabolites cellulaires ont été extraits avec 1 ml de méthanol aqueux à 80% glacé.Les cellules présentes dans la solution de méthanol ont été grattées, collectées dans un nouveau tube et centrifugées à 15 000 × g pendant 15 min à 4 °C.Recueillir 800 µl de surnageant et sécher à l’aide d’un concentrateur sous vide à grande vitesse.Les pastilles de métabolite séchées ont ensuite été analysées pour déterminer les niveaux de tryptophane par LC-MS/MS comme décrit ci-dessus.Les niveaux cellulaires de NAD (H) dans les cellules A549 (NC et shSLC7A5) ont été mesurés à l'aide d'un kit colorimétrique quantitatif NAD + / NADH (# K337, BioVision) conformément aux instructions du fabricant.Les niveaux de protéines ont été mesurés pour chaque échantillon afin de normaliser la quantité de métabolites.
Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour déterminer de manière préliminaire la taille de l'échantillon.Des études métabolomiques antérieures visant à la découverte de biomarqueurs15,18 ont été considérées comme des références pour la détermination de la taille et, comparé à ces rapports, notre échantillon était adéquat.Aucun échantillon n'a été exclu de la cohorte d'étude.Des échantillons de sérum ont été attribués au hasard à un groupe de découverte (306 cas, 74,6 %) et à un groupe de validation interne (104 cas, 25,4 %) pour des études métabolomiques non ciblées.Nous avons également sélectionné au hasard 70 cas de chaque groupe de l’ensemble de découvertes pour des études métabolomiques ciblées.Les enquêteurs n'étaient pas informés de l'affectation des groupes lors de la collecte et de l'analyse des données LC-MS.Les analyses statistiques des données métabolomiques et des expériences cellulaires sont décrites dans les sections respectives Résultats, Légendes des figures et Méthodes.La quantification du tryptophane cellulaire, du NADT et de l'activité glycolytique a été réalisée trois fois indépendamment avec des résultats identiques.
Pour plus d’informations sur la conception de l’étude, consultez le résumé du rapport sur le portefeuille naturel associé à cet article.
Les données MS brutes des caractéristiques extraites et les données MS normalisées du sérum de référence sont présentées respectivement dans les données supplémentaires 1 et les données supplémentaires 2.Les annotations de pointe pour les caractéristiques différentielles sont présentées dans les données supplémentaires 3. L'ensemble de données LUAD TCGA peut être téléchargé à partir de https://portal.gdc.cancer.gov/.Les données d'entrée pour tracer le graphique sont fournies dans les données sources.Les données sources sont fournies pour cet article.
Groupe d'étude national sur le dépistage pulmonaire, etc. Réduire la mortalité par cancer du poumon grâce à la tomodensitométrie à faible dose.Nord de l'Angleterre.J.Méd.365, 395-409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR et Prophet, PC Dépistage du cancer du poumon par tomodensitométrie hélicoïdale à faible dose : résultats de la National Lung Screening Study (NLST).J.Méd.Écran 18, 109-111 (2011).
De Koning, HJ et coll.Réduire la mortalité par cancer du poumon grâce au dépistage par tomodensitométrie volumétrique dans un essai randomisé.Nord de l'Angleterre.J.Méd.382, 503-513 (2020).
Heure de publication : 18 septembre 2023