Le diagnostic différentiel des nodules pulmonaires identifiés par tomodensitométrie (TDM) demeure un défi en pratique clinique. Dans cette étude, nous avons caractérisé le métabolome global de 480 échantillons de sérum, incluant des sujets sains, des nodules pulmonaires bénins et des adénocarcinomes pulmonaires de stade I. Les adénocarcinomes présentent des profils métabolomiques uniques, tandis que les profils métabolomiques des nodules bénins et des sujets sains sont très similaires. Dans le groupe de découverte (n = 306), un ensemble de 27 métabolites a été identifié pour différencier les nodules bénins des nodules malins. L'aire sous la courbe (AUC) du modèle discriminant était de 0,915 dans le groupe de validation interne (n = 104) et de 0,945 dans le groupe de validation externe (n = 111). L'analyse des voies métaboliques a révélé une augmentation des métabolites glycolytiques associée à une diminution du tryptophane dans le sérum des patients atteints d'adénocarcinome pulmonaire, comparativement aux nodules bénins et aux témoins sains. Ces résultats suggèrent que l'absorption du tryptophane favorise la glycolyse dans les cellules cancéreuses pulmonaires. Notre étude souligne l'intérêt des biomarqueurs métaboliques sériques pour l'évaluation du risque associé aux nodules pulmonaires détectés par tomodensitométrie.
Un diagnostic précoce est essentiel pour améliorer le taux de survie des patients atteints de cancer. Les résultats de l'étude américaine NLST (National Lung Cancer Screening Trial) et de l'étude européenne NELSON ont démontré que le dépistage par tomodensitométrie à faible dose (TDM-LD) peut réduire significativement la mortalité par cancer du poumon dans les groupes à haut risque1,2,3. Depuis la généralisation de la TDM-LD pour le dépistage du cancer du poumon, l'incidence de la découverte fortuite de nodules pulmonaires asymptomatiques à la radiographie n'a cessé d'augmenter4. Les nodules pulmonaires sont définis comme des opacités focales d'un diamètre maximal de 3 cm5. L'évaluation de la probabilité de malignité et la prise en charge du grand nombre de nodules pulmonaires détectés fortuitement par TDM-LD représentent des difficultés. Les limites de la TDM peuvent entraîner des examens de suivi fréquents et des résultats faussement positifs, conduisant à des interventions inutiles et à un surtraitement6. Il est donc nécessaire de développer des biomarqueurs fiables et utiles pour identifier correctement le cancer du poumon à un stade précoce et différencier la plupart des nodules bénins dès leur détection initiale7.
L'analyse moléculaire complète du sang (sérum, plasma, cellules mononucléaires du sang périphérique), incluant la génomique, la protéomique et la méthylation de l'ADN8,9,10, a suscité un intérêt croissant pour la découverte de biomarqueurs diagnostiques du cancer du poumon. Parallèlement, les approches métabolomiques mesurent les produits finaux cellulaires influencés par des facteurs endogènes et exogènes et sont donc utilisées pour prédire l'apparition et l'évolution de la maladie. La chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS) est une méthode largement utilisée en métabolomique en raison de sa haute sensibilité et de sa large gamme dynamique, permettant l'analyse de métabolites aux propriétés physico-chimiques variées11,12,13. Bien que l'analyse métabolomique globale du plasma/sérum ait permis d'identifier des biomarqueurs associés au diagnostic du cancer du poumon14,15,16,17 et à l'efficacité du traitement18, la classification des métabolites sériques pour distinguer les nodules pulmonaires bénins des nodules malins reste un domaine de recherche important.
L'adénocarcinome et le carcinome épidermoïde sont les deux principaux sous-types de cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC). Différents tests de dépistage par tomodensitométrie (TDM) indiquent que l'adénocarcinome est le type histologique le plus fréquent de cancer du poumon1,19,20,21. Dans cette étude, nous avons utilisé la chromatographie liquide ultra-performante couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (UPLC-HRMS) pour réaliser une analyse métabolomique sur un total de 695 échantillons de sérum, incluant des témoins sains, des nodules pulmonaires bénins et des tumeurs ≤ 3 cm détectées par TDM. Nous avons identifié un ensemble de métabolites sériques permettant de distinguer l'adénocarcinome pulmonaire des nodules bénins et des témoins sains. L'analyse d'enrichissement des voies métaboliques a révélé que des anomalies du métabolisme du tryptophane et du glucose sont des altérations fréquentes dans l'adénocarcinome pulmonaire, comparativement aux nodules bénins et aux témoins sains. Enfin, nous avons établi et validé un classificateur métabolique sérique présentant une spécificité et une sensibilité élevées pour distinguer les nodules pulmonaires malins et bénins détectés par TDM à faible dose, ce qui peut faciliter le diagnostic différentiel précoce et l'évaluation des risques.
Dans cette étude, des échantillons de sérum appariés selon l'âge et le sexe ont été recueillis rétrospectivement auprès de 174 sujets témoins sains, 292 patients présentant des nodules pulmonaires bénins et 229 patients atteints d'un adénocarcinome pulmonaire de stade I. Les caractéristiques démographiques des 695 sujets sont présentées dans le tableau supplémentaire 1.
Comme illustré sur la figure 1a, un total de 480 échantillons de sérum, comprenant 174 échantillons de témoins sains (HC), 170 échantillons de nodules bénins (BN) et 136 échantillons d'adénocarcinome pulmonaire de stade I (LA), ont été collectés au Centre de cancérologie de l'Université Sun Yat-sen. Cette cohorte de découverte a été utilisée pour le profilage métabolomique non ciblé par chromatographie liquide ultra-performante couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (UPLC-HRMS). Comme illustré sur la figure supplémentaire 1, les métabolites différentiels entre LA et HC, ainsi qu'entre LA et BN, ont été identifiés afin d'établir un modèle de classification et d'explorer plus en détail l'analyse des voies métaboliques différentielles. 104 échantillons collectés par le Centre de cancérologie de l'Université Sun Yat-sen et 111 échantillons collectés par deux autres hôpitaux ont fait l'objet d'une validation interne et externe, respectivement.
a Population étudiée dans la cohorte de découverte ayant subi une analyse métabolomique sérique globale par chromatographie liquide ultra-performante couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (UPLC-HRMS). b Analyse discriminante par les moindres carrés partiels (PLS-DA) du métabolome total de 480 échantillons de sérum issus de la cohorte étudiée, incluant des témoins sains (HC, n = 174), des nodules bénins (BN, n = 170) et un adénocarcinome pulmonaire de stade I (Los Angeles, n = 136). +ESI : mode d’ionisation par électrospray positif ; -ESI : mode d’ionisation par électrospray négatif. c–e Les métabolites présentant des abondances significativement différentes entre deux groupes (test de Wilcoxon bilatéral, valeur p ajustée pour le taux de faux positifs, FDR < 0,05) sont représentés en rouge (rapport de variation > 1,2) et en bleu (rapport de variation < 0,83) sur le graphique en volcan. f Carte thermique de classification hiérarchique montrant les différences significatives du nombre de métabolites annotés entre LA et BN. Les données sources sont fournies sous forme de fichiers.
Le métabolome sérique total de 174 sujets HC, 170 sujets BN et 136 sujets LA du groupe de découverte a été analysé par UPLC-HRMS. Nous montrons tout d'abord que les échantillons de contrôle qualité (CQ) se regroupent étroitement au centre d'un modèle d'analyse en composantes principales (ACP) non supervisée, confirmant ainsi la robustesse des résultats de cette étude (Figure supplémentaire 2).
Comme le montre l'analyse discriminante par les moindres carrés partiels (PLS-DA) de la figure 1b, nous avons constaté des différences nettes entre LA et BN, ainsi qu'entre LA et HC, en modes d'ionisation par électrospray positif (+ESI) et négatif (−ESI). En revanche, aucune différence significative n'a été observée entre BN et HC dans ces mêmes conditions.
Nous avons identifié 382 caractéristiques différentielles entre LA et HC, 231 entre LA et BN, et 95 entre BN et HC (test de Wilcoxon, FDR < 0,05 et comparaisons multiples > 1,2 ou < 0,83) (Figure 1c-e). Les pics ont ensuite été annotés (Données supplémentaires 3) à l'aide d'une base de données (bibliothèque mzCloud/HMDB/Chemspider) par valeur m/z, temps de rétention et spectre de masse de fragmentation (détails dans la section Méthodes)22. Au final, 33 et 38 métabolites annotés présentant des différences d'abondance significatives ont été identifiés pour LA vs BN (Figure 1f et Tableau supplémentaire 2) et LA vs HC (Figure supplémentaire 3 et Tableau supplémentaire 2), respectivement. En revanche, seuls 3 métabolites présentant des différences d'abondance significatives ont été identifiés entre les groupes BN et HC (Tableau supplémentaire 2), ce qui concorde avec le chevauchement observé entre ces deux groupes dans l'analyse PLS-DA. Ces métabolites différentiels couvrent un large éventail de composés biochimiques (Figure supplémentaire 4). L'ensemble de ces résultats démontre des modifications significatives du métabolome sérique, reflétant la transformation maligne du cancer du poumon à un stade précoce, comparativement aux nodules pulmonaires bénins ou aux sujets sains. Par ailleurs, la similarité du métabolome sérique entre les groupes BN et HC suggère que les nodules pulmonaires bénins pourraient partager de nombreuses caractéristiques biologiques avec les individus sains. Étant donné que les mutations du gène du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) sont fréquentes dans le sous-type 23 de l'adénocarcinome pulmonaire, nous avons cherché à déterminer l'impact des mutations activatrices sur le métabolome sérique. Nous avons ensuite analysé le profil métabolomique global de 72 cas d'adénocarcinome pulmonaire, en fonction du statut EGFR. Il est intéressant de noter que l'analyse en composantes principales (ACP) a révélé des profils comparables entre les patients porteurs de la mutation EGFR (n = 41) et ceux présentant le génotype sauvage EGFR (n = 31). Cependant, nous avons identifié sept métabolites dont l'abondance était significativement modifiée chez les patients porteurs de la mutation EGFR par rapport à ceux présentant le génotype sauvage (test t, p < 0,05 et variation d'abondance > 1,2 ou < 0,83) (Figure supplémentaire 5b). La majorité de ces métabolites (5 sur 7) sont des acylcarnitines, qui jouent un rôle important dans les voies d'oxydation des acides gras.
Comme illustré dans le flux de travail de la figure 2a, les biomarqueurs pour la classification des nodules ont été obtenus par la méthode LASSO (Least Absolute Shrinkage Operator) et une sélection basée sur 33 métabolites différentiels identifiés dans les nodules LA (n = 136) et BN (n = 170). Un modèle de régression logistique binaire a été utilisé, combinant la meilleure combinaison de variables (LASSO). Une validation croisée à 10 plis a permis de tester la fiabilité du modèle. La sélection des variables et la régularisation des paramètres ont été ajustées par une pénalité de maximisation de la vraisemblance avec le paramètre λ24. Une analyse métabolomique globale a ensuite été réalisée indépendamment dans les groupes de validation interne (n = 104) et externe (n = 111) afin d'évaluer la performance de classification du modèle discriminant. Ainsi, 27 métabolites de l'ensemble de découverte ont été identifiés comme constituant le meilleur modèle discriminant, avec la valeur moyenne d'AUC la plus élevée (figure 2b). Parmi ceux-ci, 9 présentaient une activité accrue et 18 une activité diminuée dans les nodules LA par rapport aux nodules BN (figure 2c).
Flux de travail pour la construction d'un classificateur de nodules pulmonaires, incluant la sélection du meilleur panel de métabolites sériques dans l'ensemble de découverte à l'aide d'un modèle de régression logistique binaire par validation croisée à dix plis et l'évaluation des performances prédictives dans les ensembles de validation interne et externe. b Statistiques de validation croisée du modèle de régression LASSO pour la sélection des biomarqueurs métaboliques. Les nombres indiqués ci-dessus représentent le nombre moyen de biomarqueurs sélectionnés pour un λ donné. La ligne pointillée rouge représente la valeur moyenne de l'AUC pour le lambda correspondant. Les barres d'erreur grises représentent les valeurs minimales et maximales de l'AUC. La ligne pointillée indique le meilleur modèle avec les 27 biomarqueurs sélectionnés. AUC : aire sous la courbe ROC (Receiver Operating Characteristic). c Variations d'expression des 27 métabolites sélectionnés dans le groupe LA par rapport au groupe BN dans l'ensemble de découverte. Colonne rouge : activation. Colonne bleue : diminution. d–f Courbes ROC (Receiver Operating Characteristic) montrant la puissance du modèle discriminant basé sur 27 combinaisons de métabolites dans les ensembles de découverte, de validation interne et externe. Les données sources sont fournies sous forme de fichiers de données sources.
Un modèle de prédiction a été créé à partir des coefficients de régression pondérés de ces 27 métabolites (Tableau supplémentaire 3). L'analyse ROC basée sur ces 27 métabolites a donné une aire sous la courbe (AUC) de 0,933, une sensibilité de 0,868 et une spécificité de 0,859 (Fig. 2d). Parallèlement, parmi les 38 métabolites différentiels annotés entre LA et HC, un ensemble de 16 métabolites a atteint une AUC de 0,902, avec une sensibilité de 0,801 et une spécificité de 0,856 pour la discrimination entre LA et HC (Figures supplémentaires 6a-c). Les valeurs d'AUC obtenues en fonction de différents seuils de variation d'expression des métabolites différentiels ont également été comparées. Nous avons constaté que le modèle de classification était le plus performant pour discriminer entre LA et BN (HC) lorsque le seuil de variation d'expression était fixé à 1,2, comparativement à 1,5 ou 2,0 (Figures supplémentaires 7a et 7b). Le modèle de classification, basé sur 27 groupes de métabolites, a été validé sur des cohortes internes et externes. L'aire sous la courbe (AUC) était de 0,915 (sensibilité : 0,867 ; spécificité : 0,811) pour la validation interne et de 0,945 (sensibilité : 0,810 ; spécificité : 0,979) pour la validation externe (Fig. 2e, f). Afin d'évaluer la reproductibilité interlaboratoire, 40 échantillons de la cohorte externe ont été analysés dans un laboratoire externe, comme décrit dans la section Méthodes. La précision de la classification a atteint une AUC de 0,925 (Figure supplémentaire 8). Le carcinome épidermoïde du poumon (LUSC) étant le deuxième sous-type le plus fréquent de cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) après l'adénocarcinome pulmonaire (LUAD), nous avons également testé l'utilité potentielle validée des profils métaboliques. BN et 16 cas de LUSC ont été analysés. L'AUC de discrimination entre LUSC et BN était de 0,776 (figure supplémentaire 9), indiquant une capacité inférieure à celle de discrimination entre LUAD et BN.
Des études ont montré que la taille des nodules sur les images tomodensitométriques est positivement corrélée à la probabilité de malignité et demeure un déterminant majeur du traitement des nodules25,26,27. L'analyse des données de la vaste cohorte de l'étude de dépistage NELSON a montré que le risque de malignité chez les sujets présentant des nodules de moins de 5 mm était même similaire à celui des sujets sans nodules28. Par conséquent, la taille minimale nécessitant une surveillance tomodensitométrique régulière est de 5 mm, comme le recommande la British Thoracic Society (BTS), et de 6 mm, comme le recommande la Fleischner Society29. Cependant, les nodules de plus de 6 mm et sans caractéristiques bénignes évidentes, appelés nodules pulmonaires indéterminés (NPI), représentent toujours un défi majeur pour leur évaluation et leur prise en charge en pratique clinique30,31. Nous avons ensuite examiné si la taille des nodules influençait les signatures métabolomiques à l'aide d'échantillons regroupés provenant des cohortes de découverte et de validation interne. En nous concentrant sur 27 biomarqueurs validés, nous avons d'abord comparé les profils d'ACP des métabolomes de moins de 6 mm des groupes HC et BN. Nous avons constaté que la plupart des points de données des deux groupes se chevauchaient, démontrant ainsi que les concentrations de métabolites sériques étaient similaires (Fig. 3a). Les cartes de caractéristiques restaient conservées pour différentes tailles de nodules dans les groupes BN et LA (Fig. 3b, c), tandis qu'une séparation était observée entre les nodules malins et bénins dans la gamme de 6 à 20 mm (Fig. 3d). Cette cohorte présentait une AUC de 0,927, une spécificité de 0,868 et une sensibilité de 0,820 pour la prédiction de la malignité des nodules mesurant de 6 à 20 mm (Fig. 3e, f). Nos résultats montrent que le classificateur peut détecter les modifications métaboliques induites par une transformation maligne précoce, quelle que soit la taille du nodule.
ad Comparaison des profils ACP entre des groupes spécifiques, basée sur un classificateur métabolique de 27 métabolites. CC et BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. dans LA 6–20 mm vs LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm et LA 6–20 mm. GC, n = 174 ; BN < 6 mm, n = 153 ; BN 6–20 mm, n = 91 ; LA 6–20 mm, n = 89 ; LA 20–30 mm, n = 77. e Courbe ROC (Receiver Operating Characteristic) montrant la performance du modèle discriminant pour les nodules de 6 à 20 mm. f Les valeurs de probabilité ont été calculées à partir du modèle de régression logistique pour les nodules mesurant de 6 à 20 mm. La ligne pointillée grise représente la valeur seuil optimale (0,455). Les chiffres ci-dessus représentent le pourcentage de cas projetés pour Los Angeles. Utilisez un test t de Student bilatéral. ACP : analyse en composantes principales. AUC : aire sous la courbe. Les données sources sont fournies sous forme de fichiers.
Quatre échantillons (patients âgés de 44 à 61 ans) présentant des nodules pulmonaires de taille similaire (7 à 9 mm) ont été sélectionnés pour illustrer les performances du modèle de prédiction de malignité proposé (Fig. 4a, b). Lors du dépistage initial, le cas 1 se présentait comme un nodule solide calcifié, caractéristique associée à la bénignité, tandis que le cas 2 se présentait comme un nodule partiellement solide indéterminé, sans signe évident de bénignité. Trois examens tomodensitométriques de suivi ont montré la stabilité de ces nodules sur une période de 4 ans, confirmant leur bénignité (Fig. 4a). Comparée à l'évaluation clinique des examens tomodensitométriques sériés, l'analyse métabolique sérique en une seule étape, réalisée avec le modèle de classification actuel, a permis d'identifier rapidement et correctement ces nodules bénins, en se basant sur des contraintes probabilistes (Tableau 1). La figure 4b, concernant le cas 3, montre un nodule présentant des signes de rétraction pleurale, fréquemment associés à la malignité32. Le cas 4 se présentait sous la forme d’un nodule partiellement solide indéterminé, sans signe de bénignité. Tous ces cas ont été prédits comme malins par le modèle de classification (tableau 1). Le diagnostic d’adénocarcinome pulmonaire a été confirmé par examen histopathologique après résection pulmonaire (figure 4b). Sur l’ensemble de validation externe, le classificateur métabolique a prédit avec précision deux cas de nodules pulmonaires indéterminés de plus de 6 mm (figure supplémentaire 10).
Images tomodensitométriques (TDM) en coupe axiale des poumons de deux cas de nodules bénins. Dans le cas 1, la TDM réalisée 4 ans plus tard a montré un nodule solide stable de 7 mm avec calcification dans le lobe inférieur droit. Dans le cas 2, la TDM réalisée 5 ans plus tard a révélé un nodule stable, partiellement solide, de 7 mm de diamètre dans le lobe supérieur droit. b Images TDM en coupe axiale des poumons et études anatomopathologiques correspondantes de deux cas d'adénocarcinome de stade I avant résection pulmonaire. Le cas 3 a révélé un nodule de 8 mm de diamètre dans le lobe supérieur droit avec rétraction pleurale. Le cas 4 a révélé un nodule partiellement solide en verre dépoli de 9 mm dans le lobe supérieur gauche. Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) du tissu pulmonaire réséqué (échelle : 50 µm) montrant le mode de croissance acinaire de l'adénocarcinome pulmonaire. Les flèches indiquent les nodules détectés sur les images TDM. Les images H&E sont des images représentatives de plusieurs (>3) champs microscopiques examinés par le pathologiste.
Pris dans leur ensemble, nos résultats démontrent la valeur potentielle des biomarqueurs métaboliques sériques dans le diagnostic différentiel des nodules pulmonaires, ce qui peut poser des difficultés lors de l'évaluation du dépistage par tomodensitométrie.
À partir d'un panel de métabolites différentiels validé, nous avons cherché à identifier les corrélats biologiques des principales modifications métaboliques. L'analyse d'enrichissement des voies KEGG par MetaboAnalyst a identifié six voies métaboliques communes significativement altérées entre les deux groupes (LA vs HC et LA vs BN, p ajusté ≤ 0,001, effet > 0,01). Ces modifications étaient caractérisées par des perturbations du métabolisme du pyruvate, du tryptophane, de la niacine et du nicotinamide, de la glycolyse, du cycle de Krebs et du métabolisme des purines (Fig. 5a). Nous avons ensuite réalisé une métabolomique ciblée pour confirmer ces modifications majeures par quantification absolue. La détermination des métabolites communs dans les voies métaboliques altérées a été effectuée par spectrométrie de masse à triple quadripôle (QQQ) à l'aide d'étalons de métabolites authentiques. Les caractéristiques démographiques de l'échantillon cible de l'étude métabolomique sont présentées dans le tableau supplémentaire 4. Conformément à nos résultats métabolomiques globaux, l'analyse quantitative a confirmé une augmentation de l'hypoxanthine, de la xanthine, du pyruvate et du lactate dans le groupe LA par rapport aux groupes BN et HC (Fig. 5b, c, p < 0,05). En revanche, aucune différence significative n'a été observée pour ces métabolites entre les groupes BN et HC.
Analyse d'enrichissement des voies KEGG des métabolites significativement différents dans le groupe LA par rapport aux groupes BN et HC. Un test global bilatéral a été utilisé et les valeurs p ont été ajustées par la méthode de Holm-Bonferroni (p ajusté ≤ 0,001 et taille de l'effet > 0,01). b–d Diagrammes en violon montrant les concentrations sériques d'hypoxanthine, de xanthine, de lactate, de pyruvate et de tryptophane chez les sujets HC, BN et LA, déterminées par LC-MS/MS (n = 70 par groupe). Les lignes pointillées blanches et noires indiquent respectivement la médiane et les quartiles. e Diagramme en violon montrant l'expression normalisée (Log2TPM, transcrits par million) des ARNm de SLC7A5 et QPRT dans l'adénocarcinome pulmonaire (n = 513) par rapport au tissu pulmonaire normal (n = 59) dans l'ensemble de données LUAD-TCGA. La boîte blanche représente l'intervalle interquartile, la ligne noire horizontale au centre représente la médiane et la ligne noire verticale partant de la boîte représente l'intervalle de confiance à 95 % (IC). f Graphique de corrélation de Pearson de l'expression de SLC7A5 et de GAPDH dans l'adénocarcinome pulmonaire (n = 513) et le tissu pulmonaire normal (n = 59) de l'ensemble de données TCGA. La zone grise représente l'IC à 95 %. r, coefficient de corrélation de Pearson. g Taux de tryptophane cellulaire normalisés dans les cellules A549 transfectées avec un shARN contrôle non spécifique (NC) et shSLC7A5 (Sh1, Sh2), déterminés par LC-MS/MS. L'analyse statistique de cinq échantillons biologiquement indépendants dans chaque groupe est présentée. h Taux cellulaires de NADt (NAD total, incluant NAD+ et NADH) dans les cellules A549 (NC) et les cellules A549 dont l'expression de SLC7A5 a été inhibée (Sh1, Sh2). L'analyse statistique de trois échantillons biologiquement indépendants par groupe est présentée. i L'activité glycolytique des cellules A549 avant et après l'inhibition de SLC7A5 a été mesurée par le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) (n = 4 échantillons biologiquement indépendants par groupe). 2-DG : 2-désoxy-D-glucose. Un test t de Student bilatéral a été utilisé dans les figures (b–h). Dans les figures (g–i), les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'écart-type. Chaque expérience a été réalisée trois fois indépendamment et les résultats étaient similaires. Les données sources sont fournies sous forme de fichiers.
Compte tenu de l'impact significatif de l'altération du métabolisme du tryptophane dans le groupe LA, nous avons également évalué les taux sériques de tryptophane dans les groupes HC, BN et LA par la méthode QQQ. Nous avons constaté une diminution du tryptophane sérique dans le groupe LA comparativement aux groupes HC et BN (p < 0,001, Figure 5d), ce qui concorde avec des résultats antérieurs montrant que les taux de tryptophane circulant sont plus faibles chez les patients atteints de cancer du poumon que chez les sujets sains du groupe contrôle33,34,35. Une autre étude utilisant le traceur TEP/TDM 11C-méthyl-L-tryptophane a révélé que le temps de rétention du signal du tryptophane dans le tissu cancéreux pulmonaire était significativement augmenté par rapport aux lésions bénignes ou au tissu normal36. Nous émettons l'hypothèse que la diminution du tryptophane dans le sérum du groupe LA pourrait refléter une captation active du tryptophane par les cellules cancéreuses pulmonaires.
Il est également établi que le produit final de la voie de la kynurénine du catabolisme du tryptophane est le NAD+37,38, un substrat important pour la réaction du glycéraldéhyde-3-phosphate avec le 1,3-bisphosphoglycérate lors de la glycolyse39. Alors que les études précédentes se sont concentrées sur le rôle du catabolisme du tryptophane dans la régulation immunitaire, nous avons cherché à élucider l'interaction entre la dérégulation du tryptophane et les voies glycolytiques observée dans la présente étude. Le transporteur de solutés de la famille 7, membre 5 (SLC7A5), est connu pour être un transporteur de tryptophane43,44,45. La quinolinique phosphoribosyltransférase (QPRT) est une enzyme située en aval de la voie de la kynurénine qui convertit l'acide quinolinique en NAMN46. L'analyse de l'ensemble de données TCGA du LUAD a révélé que SLC7A5 et QPRT étaient tous deux significativement surexprimés dans le tissu tumoral par rapport au tissu normal (Fig. 5e). Cette augmentation a été observée aux stades I et II ainsi qu'aux stades III et IV de l'adénocarcinome pulmonaire (figure supplémentaire 11), indiquant des perturbations précoces du métabolisme du tryptophane associées à la tumorigénèse.
De plus, l'ensemble de données LUAD-TCGA a révélé une corrélation positive entre l'expression des ARNm de SLC7A5 et de GAPDH dans les échantillons de patients atteints de cancer (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figure 5f). En revanche, aucune corrélation significative n'a été observée entre ces signatures géniques dans le tissu pulmonaire normal (r = 0,25, p = 0,06, Figure 5f). L'inhibition de l'expression de SLC7A5 (Figure supplémentaire 12) dans les cellules A549 a significativement réduit les taux cellulaires de tryptophane et de NAD(H) (Figure 5g,h), entraînant une diminution de l'activité glycolytique, mesurée par le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) (Figure 1i). Ainsi, sur la base des modifications métaboliques sériques et des observations in vitro, nous formulons l'hypothèse que le métabolisme du tryptophane pourrait produire du NAD+ via la voie de la kynurénine et jouer un rôle important dans la promotion de la glycolyse dans le cancer du poumon.
Des études ont montré qu'un grand nombre de nodules pulmonaires indéterminés détectés par TDM à faible dose peuvent entraîner la nécessité d'examens complémentaires tels que la TEP-TDM, la biopsie pulmonaire et un surtraitement en raison d'un diagnostic faussement positif de malignité.31 Comme le montre la figure 6, notre étude a identifié un panel de métabolites sériques ayant une valeur diagnostique potentielle qui pourrait améliorer la stratification des risques et la prise en charge ultérieure des nodules pulmonaires détectés par TDM.
Les nodules pulmonaires sont évalués par tomodensitométrie à faible dose (TDM-LD), les caractéristiques d'imagerie pouvant suggérer une étiologie bénigne ou maligne. L'évolution incertaine de ces nodules peut entraîner des consultations de suivi fréquentes, des interventions inutiles et un surtraitement. L'intégration de marqueurs métaboliques sériques à valeur diagnostique pourrait améliorer l'évaluation du risque et la prise en charge ultérieure des nodules pulmonaires. Tomographie par émission de positons (TEP).
Les données des études américaines NLST et européennes NELSON suggèrent que le dépistage des groupes à haut risque par tomodensitométrie à faible dose (TDM-LD) pourrait réduire la mortalité par cancer du poumon1,3. Cependant, l’évaluation du risque et la prise en charge clinique ultérieure d’un grand nombre de nodules pulmonaires découverts fortuitement par TDM-LD demeurent les principaux défis. L’objectif principal est d’optimiser la classification des protocoles existants basés sur la TDM-LD en y intégrant des biomarqueurs fiables.
Certains biomarqueurs moléculaires, tels que les métabolites sanguins, ont été identifiés par comparaison de cancers du poumon avec des sujets sains15,17. Dans cette étude, nous avons examiné l'application de l'analyse métabolomique sérique pour distinguer les nodules pulmonaires bénins et malins détectés fortuitement par TDM à faible dose. Nous avons comparé le métabolome sérique global d'échantillons de sujets sains (HC), de nodules pulmonaires bénins (BN) et d'adénocarcinomes pulmonaires de stade I (LA) par analyse UPLC-HRMS. Nos résultats montrent que les profils métaboliques des sujets sains et des BN sont similaires, tandis que ceux des LA diffèrent significativement de ceux des sujets sains et des BN. Nous avons identifié deux groupes de métabolites sériques permettant de différencier les LA des sujets sains et des BN.
Le système actuel d'identification des nodules bénins et malins par tomodensitométrie à faible dose (TDM-LD) repose principalement sur leur taille, leur densité, leur morphologie et leur vitesse de croissance au fil du temps30. Des études antérieures ont montré que la taille des nodules est étroitement liée à la probabilité de cancer du poumon. Même chez les patients à haut risque, le risque de malignité des nodules de moins de 6 mm est inférieur à 1 %. Ce risque, pour les nodules mesurant entre 6 et 20 mm, varie de 8 % à 64 %30. C'est pourquoi la Société Fleischner recommande un diamètre seuil de 6 mm pour le suivi TDM de routine29. Cependant, l'évaluation du risque et la prise en charge des nodules pulmonaires indéterminés (NPI) de plus de 6 mm restent insuffisantes31. La prise en charge actuelle des cardiopathies congénitales repose généralement sur une surveillance attentive avec des TDM fréquentes.
À partir du métabolome validé, nous avons démontré pour la première fois le chevauchement des signatures métabolomiques entre les individus sains et les nodules bénins de moins de 6 mm. Cette similarité biologique concorde avec les résultats antérieurs de tomodensitométrie (TDM) montrant que le risque de malignité pour les nodules de moins de 6 mm est aussi faible que chez les sujets sans nodules.30 Il convient de noter que nos résultats démontrent également que les nodules bénins de moins de 6 mm et de 6 mm et plus présentent une forte similarité de profils métabolomiques, suggérant que la définition fonctionnelle de l'étiologie bénigne est cohérente quelle que soit la taille du nodule. Ainsi, les panels modernes de métabolites sériques à visée diagnostique pourraient constituer un test unique d'exclusion lors de la détection initiale de nodules par TDM et potentiellement réduire la fréquence des examens de suivi. Parallèlement, ce même panel de biomarqueurs métaboliques a permis de distinguer les nodules malins de 6 mm et plus des nodules bénins et de prédire avec précision les nodules pulmonaires intraépithéliaux (NPI) de taille similaire et présentant des caractéristiques morphologiques ambiguës sur les images TDM. Ce classificateur du métabolisme sérique a permis de prédire avec succès la malignité des nodules ≥ 6 mm avec une AUC de 0,927. L'ensemble de nos résultats indique que des signatures métabolomiques sériques uniques peuvent refléter spécifiquement les changements métaboliques précoces induits par la tumeur et avoir une valeur potentielle en tant que prédicteurs de risque, indépendamment de la taille du nodule.
Il convient de noter que l'adénocarcinome pulmonaire (LUAD) et le carcinome épidermoïde (LUSC) sont les principaux types de cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC). Étant donné que le LUSC est fortement associé au tabagisme47 et que le LUAD est le type histologique le plus fréquemment observé pour les nodules pulmonaires découverts fortuitement lors d'un dépistage par tomodensitométrie48, notre modèle de classification a été spécifiquement conçu pour les échantillons d'adénocarcinome de stade I. Wang et ses collègues se sont également intéressés au LUAD et ont identifié neuf signatures lipidiques par lipidomique afin de distinguer les cancers du poumon de stade précoce des individus sains17. Nous avons testé le modèle de classification actuel sur 16 cas de LUSC de stade I et 74 nodules bénins et observé une faible précision de prédiction du LUSC (AUC 0,776), suggérant que le LUAD et le LUSC pourraient présenter des signatures métabolomiques distinctes. En effet, il a été démontré que le LUAD et le LUSC diffèrent par leur étiologie, leur origine biologique et leurs anomalies génétiques49. Par conséquent, d'autres types d'histologie devraient être inclus dans les modèles de formation pour la détection du cancer du poumon à l'échelle de la population dans le cadre des programmes de dépistage.
Dans cette étude, nous avons identifié les six voies métaboliques les plus fréquemment altérées dans l'adénocarcinome pulmonaire, comparativement aux témoins sains et aux nodules bénins. La xanthine et l'hypoxanthine sont des métabolites courants de la voie métabolique des purines. Conformément à nos résultats, les intermédiaires associés au métabolisme des purines étaient significativement augmentés dans le sérum et les tissus des patients atteints d'adénocarcinome pulmonaire, comparativement aux témoins sains et aux patients au stade pré-invasif15,50. L'élévation des taux sériques de xanthine et d'hypoxanthine pourrait refléter l'anabolisme requis par la prolifération rapide des cellules cancéreuses. La dérégulation du métabolisme du glucose est une caractéristique bien connue du métabolisme cancéreux51. Nous avons observé une augmentation significative du pyruvate et du lactate dans le groupe LA, comparativement aux groupes HC et BN, ce qui concorde avec les résultats antérieurs faisant état d'anomalies de la voie glycolytique dans les profils métaboliques sériques de patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) et de témoins sains. Ces résultats sont cohérents52,53.
Il est important de noter que nous avons observé une corrélation inverse entre le métabolisme du pyruvate et celui du tryptophane dans le sérum des patients atteints d'adénocarcinome pulmonaire. Les taux sériques de tryptophane étaient réduits dans le groupe LA comparativement aux groupes HC et BN. Fait intéressant, une étude antérieure de grande envergure, menée sur une cohorte prospective, a révélé que de faibles taux de tryptophane circulant étaient associés à un risque accru de cancer du poumon54. Le tryptophane est un acide aminé essentiel que nous obtenons exclusivement par l'alimentation. Nous concluons que la diminution du tryptophane sérique observée dans l'adénocarcinome pulmonaire pourrait refléter une déplétion rapide de ce métabolite. Il est bien établi que le produit final du catabolisme du tryptophane via la voie de la kynurénine est à l'origine de la synthèse de novo du NAD+. Le NAD+ étant principalement produit par la voie de récupération, son rôle dans le métabolisme du tryptophane, en conditions physiologiques et pathologiques, reste à déterminer46. Notre analyse de la base de données TCGA a révélé que l'expression du transporteur de tryptophane SLC7A5 était significativement augmentée dans l'adénocarcinome pulmonaire par rapport aux témoins sains et corrélée positivement à l'expression de l'enzyme glycolytique GAPDH. Les études précédentes se sont principalement intéressées au rôle du catabolisme du tryptophane dans la suppression de la réponse immunitaire antitumorale40,41,42. Nous démontrons ici que l'inhibition de l'absorption du tryptophane par l'inactivation de SLC7A5 dans les cellules cancéreuses pulmonaires entraîne une diminution des taux de NAD+ et une atténuation concomitante de l'activité glycolytique. En résumé, notre étude fournit une base biologique aux modifications du métabolisme sérique associées à la transformation maligne de l'adénocarcinome pulmonaire.
Les mutations de l'EGFR sont les mutations motrices les plus fréquentes chez les patients atteints de CBNPC. Dans notre étude, nous avons constaté que les patients porteurs d'une mutation de l'EGFR (n = 41) présentaient des profils métabolomiques globaux similaires à ceux des patients présentant un EGFR de type sauvage (n = 31), malgré une diminution des taux sériques d'acylcarnitines chez certains patients porteurs de la mutation. La fonction établie des acylcarnitines est de transporter les groupements acyle du cytoplasme vers la matrice mitochondriale, induisant l'oxydation des acides gras pour produire de l'énergie55. Conformément à nos résultats, une étude récente a également identifié des profils métabolomiques similaires entre les tumeurs mutées et non mutées pour l'EGFR, en analysant le métabolome global de 102 échantillons de tissu d'adénocarcinome pulmonaire50. Fait intéressant, la présence d'acylcarnitines a également été observée dans le groupe porteur de la mutation de l'EGFR. Par conséquent, il serait pertinent d'étudier plus avant si les variations des taux d'acylcarnitines reflètent les modifications métaboliques induites par l'EGFR et les voies moléculaires sous-jacentes.
En conclusion, notre étude établit un classificateur métabolique sérique pour le diagnostic différentiel des nodules pulmonaires et propose un flux de travail qui peut optimiser l'évaluation des risques et faciliter la prise en charge clinique basée sur le dépistage par tomodensitométrie.
Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique de l'hôpital universitaire de cancérologie Sun Yat-sen, du premier hôpital affilié de l'université Sun Yat-sen et du comité d'éthique de l'hôpital universitaire de cancérologie de Zhengzhou. Dans les groupes de découverte et de validation interne, 174 échantillons de sérum provenant de sujets sains et 244 échantillons de sérum provenant de nodules bénins ont été prélevés chez des patients se soumettant à des examens médicaux annuels au Département de contrôle et de prévention du cancer du centre de cancérologie de l'université Sun Yat-sen. Des échantillons de sérum provenant de nodules bénins et de 166 adénocarcinomes pulmonaires de stade I ont été collectés auprès du centre de cancérologie de l'université Sun Yat-sen. Dans la cohorte de validation externe, on comptait 48 cas de nodules bénins, 39 cas d'adénocarcinomes pulmonaires de stade I provenant du premier hôpital affilié de l'université Sun Yat-sen et 24 cas d'adénocarcinomes pulmonaires de stade I provenant de l'hôpital de cancérologie de Zhengzhou. Le Centre de cancérologie de l'Université Sun Yat-sen a également recueilli 16 cas de cancer du poumon épidermoïde de stade I afin de tester la capacité diagnostique du classificateur métabolique établi (les caractéristiques des patients sont présentées dans le tableau supplémentaire 5). Les échantillons des cohortes de découverte et de validation interne ont été recueillis entre janvier 2018 et mai 2020. Les échantillons de la cohorte de validation externe ont été recueillis entre août 2021 et octobre 2022. Afin de minimiser les biais liés au sexe, un nombre approximativement égal de cas masculins et féminins a été attribué à chaque cohorte. Le sexe des participants a été déterminé par auto-déclaration. Un consentement éclairé a été obtenu de tous les participants et aucune compensation n'a été versée. Les sujets présentant des nodules bénins étaient ceux dont le score tomodensitométrique était stable entre 2 et 5 ans au moment de l'analyse, à l'exception d'un cas de l'échantillon de validation externe, recueilli en préopératoire et diagnostiqué par histopathologie. Les cas d'adénocarcinome pulmonaire ont été recueillis avant la résection pulmonaire et confirmés par un diagnostic anatomopathologique, à l'exception des cas de bronchite chronique. Des échantillons de sang à jeun ont été prélevés dans des tubes de séparation de sérum sans anticoagulant. Après coagulation pendant une heure à température ambiante, les échantillons ont été centrifugés à 2 851 g pendant 10 minutes à 4 °C afin de recueillir le surnageant de sérum. Des aliquotes de sérum ont été congelées à -80 °C jusqu’à l’extraction des métabolites. Le Département de prévention du cancer et d’examens médicaux du Centre de cancérologie de l’Université Sun Yat-sen a constitué un pool de sérum auprès de 100 donneurs sains, hommes et femmes en nombre égal, âgés de 40 à 55 ans. Des volumes égaux de chaque échantillon ont été mélangés, le pool obtenu a été aliquoté et conservé à -80 °C. Ce mélange de sérum a servi de matériau de référence pour le contrôle qualité et la standardisation des données.
Le sérum de référence et les échantillons à analyser ont été décongelés et les métabolites extraits par une méthode d'extraction combinée (MTBE/méthanol/eau)56. Brièvement, 50 μl de sérum ont été mélangés à 225 μl de méthanol glacé et à 750 μl d'éther méthylique tert-butylique (MTBE) glacé. Le mélange a été agité et incubé sur glace pendant 1 heure. Les échantillons ont ensuite été mélangés par vortex avec 188 μl d'eau de qualité MS contenant des étalons internes (lactate-13C, pyruvate-13C, méthionine-13C et isoleucine-13C, fournis par Cambridge Isotope Laboratories). Le mélange a ensuite été centrifugé à 15 000 × g pendant 10 min à 4 °C, et la phase inférieure a été transférée dans deux tubes (125 μl chacun) pour analyse par LC-MS en modes positif et négatif. Enfin, l'échantillon a été évaporé à sec dans un concentrateur sous vide à grande vitesse.
Les métabolites lyophilisés ont été reconstitués dans 120 μl d'acétonitrile à 80 %, vortexés pendant 5 min, puis centrifugés à 15 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Les surnageants ont été transférés dans des flacons en verre ambré munis de micro-inserts pour les analyses métabolomiques. Une analyse métabolomique non ciblée a été réalisée par chromatographie liquide ultra-performante couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (UPLC-HRMS). La séparation des métabolites a été effectuée à l'aide d'un système UPLC Dionex Ultimate 3000 et d'une colonne ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). En mode ion positif, les phases mobiles étaient composées de 95 % (A) et 50 % d'acétonitrile (B), contenant chacune 10 mmol/L d'acétate d'ammonium et 0,1 % d'acide formique. En mode négatif, les phases mobiles A et B contenaient respectivement 95 % et 50 % d'acétonitrile. Les deux phases contenaient 10 mmol/L d'acétate d'ammonium, à pH 9. Le programme de gradient était le suivant : 0–0,5 min, 2 % B ; 0,5–12 min, 2–50 % B ; 12–14 min, 50–98 % B ; 14–16 min, 98 % B ; 16–16,1 min, 98–2 % B ; 16,1–20 min, 2 % B. La colonne était maintenue à 40 °C et l'échantillon à 10 °C dans l'échantillonneur automatique. Le débit était de 0,3 ml/min et le volume d'injection de 3 μl. Un spectromètre de masse Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) équipé d'une source d'ionisation par électrospray (ESI) a été utilisé en mode balayage complet et couplé au mode de surveillance ddMS2 pour l'acquisition de volumes importants de données. Les paramètres de spectrométrie de masse étaient les suivants : tension de pulvérisation +3,8 kV/-3,2 kV, température du capillaire 320 °C, gaz de protection 40 bar, gaz auxiliaire 10 bar, température de la sonde 350 °C, plage de balayage 70–1050 m/h, résolution 70 000. L'acquisition des données a été réalisée avec le logiciel Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Pour évaluer la qualité des données, des échantillons de contrôle qualité (CQ) ont été préparés en prélevant des aliquotes de 10 μL du surnageant de chaque échantillon. Six injections d'échantillons de contrôle qualité ont été analysées en début de séquence analytique afin d'évaluer la stabilité du système UPLC-MS. Ces échantillons sont ensuite introduits périodiquement dans le lot. Les 11 lots d'échantillons de sérum de cette étude ont été analysés par LC-MS. Des aliquotes d'un pool de sérum provenant de 100 donneurs sains ont servi de référence dans chaque lot pour contrôler le processus d'extraction et corriger les effets inter-lots. L'analyse métabolomique non ciblée des cohortes de découverte, de validation interne et de validation externe a été réalisée au Centre de métabolomique de l'Université Sun Yat-sen. Le laboratoire externe du Centre d'analyse et d'essais de l'Université de technologie du Guangdong a également analysé 40 échantillons de la cohorte externe afin d'évaluer les performances du modèle de classification.
Après extraction et reconstitution, la quantification absolue des métabolites sériques a été réalisée par chromatographie liquide à ultra-haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (CLHP-SM/SM) (Agilent 6495 triple quadripôle) avec une source d'ionisation par électrospray (ESI) en mode de surveillance des réactions multiples (MRM). Une colonne ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) a été utilisée pour la séparation des métabolites. La phase mobile était composée de 90 % (A) et 5 % d'acétonitrile (B) contenant 10 mmol/L d'acétate d'ammonium et 0,1 % d'ammoniaque. Le programme de gradient était le suivant : 0–1,5 min, 0 % B ; 1,5–6,5 min, 0–15 % B ; 6,5–8 min, 15 % B ; 8–8,5 min, 15 % B–0 % B ; 8,5–11,5 min, 0 % B. La colonne a été maintenue à 40 °C et l'échantillon à 10 °C dans l'échantillonneur automatique. Le débit était de 0,3 mL/min et le volume d'injection de 1 μL. Les paramètres de spectrométrie de masse étaient les suivants : tension capillaire ±3,5 kV, pression du nébuliseur 35 psi, débit de gaz de gaine 12 L/min, température du gaz de gaine 350 °C, température du gaz de séchage 250 °C et débit du gaz de séchage 14 L/min. Les taux de conversion MRM du tryptophane, du pyruvate, du lactate, de l'hypoxanthine et de la xanthine étaient respectivement de 205,0 à 187,9, de 87,0 à 43,4, de 89,0 à 43,3, de 135,0 à 92,3 et de 151,0 à 107,9. Les données ont été acquises à l'aide du logiciel Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Pour les échantillons de sérum, le tryptophane, le pyruvate, le lactate, l'hypoxanthine et la xanthine ont été quantifiés à l'aide de courbes d'étalonnage établies avec des solutions étalons. Pour les échantillons cellulaires, la teneur en tryptophane a été normalisée par rapport à l'étalon interne et à la masse protéique cellulaire.
L'extraction des pics (m/z et temps de rétention [TR]) a été réalisée à l'aide des logiciels Compound Discovery 3.1 et TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Afin d'éliminer les différences potentielles entre les lots, chaque pic caractéristique de l'échantillon test a été divisé par le pic caractéristique du matériau de référence du même lot pour obtenir l'abondance relative. Les écarts-types relatifs des standards internes avant et après standardisation sont présentés dans le Tableau supplémentaire 6. Les différences entre les deux groupes ont été caractérisées par le taux de faux positifs (FDR < 0,05, test de Wilcoxon) et le facteur de variation (> 1,2 ou < 0,83). Les données MS brutes des caractéristiques extraites et les données MS corrigées par rapport au sérum de référence sont présentées respectivement dans les Données supplémentaires 1 et 2. L'annotation des pics a été effectuée selon quatre niveaux d'identification définis : métabolites identifiés, composés putativement annotés, classes de composés putativement caractérisées et composés inconnus22. À partir des recherches dans les bases de données Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), les composés biologiques présentant une correspondance MS/MS avec des standards validés ou des annotations de correspondance exacte dans mzCloud (score > 85) ou Chemspider ont été sélectionnés comme intermédiaires au sein du métabolome différentiel. Les annotations des pics pour chaque caractéristique sont incluses dans les données supplémentaires 3. MetaboAnalyst 5.0 a été utilisé pour l'analyse univariée de l'abondance des métabolites normalisée par la somme. MetaboAnalyst 5.0 a également évalué l'enrichissement des voies KEGG à partir des métabolites significativement différents. L'analyse en composantes principales (ACP) et l'analyse discriminante par les moindres carrés partiels (PLS-DA) ont été réalisées à l'aide du logiciel ropls (v.1.26.4) avec normalisation de la pile et autoscaling. Le modèle optimal de biomarqueurs métaboliques pour la prédiction de la malignité des nodules a été généré par régression logistique binaire avec LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator, package R v.4.1-3). Les performances du modèle discriminant sur les ensembles de détection et de validation ont été caractérisées par l'estimation de l'AUC (aire sous la courbe ROC) à l'aide du logiciel pROC (version 1.18.0). Le seuil de probabilité optimal a été déterminé en fonction de l'indice de Youden maximal du modèle (sensibilité + spécificité – 1). Les échantillons dont la valeur est inférieure ou supérieure à ce seuil seront respectivement classés comme nodules bénins et comme adénocarcinomes pulmonaires.
Les cellules A549 (n° CCL-185, American Type Culture Collection) ont été cultivées dans du milieu F-12K contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS). Des séquences d'ARN en épingle à cheveux courts (shRNA) ciblant SLC7A5 et un contrôle non ciblant (NC) ont été insérées dans le vecteur lentiviral pLKO.1-puro. Les séquences antisens de shSLC7A5 sont les suivantes : Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Les anticorps anti-SLC7A5 (n° 5347) et anti-tubuline (n° 2148) ont été achetés auprès de Cell Signaling Technology. Ces anticorps ont été utilisés à une dilution de 1/1000 pour l'analyse par Western blot.
Le test de stress glycolytique Seahorse XF mesure les niveaux d'acidification extracellulaire (ECAR). Dans ce test, le glucose, l'oligomycine A et le 2-DG ont été administrés successivement afin d'évaluer la capacité glycolytique cellulaire, mesurée par l'ECAR.
Des cellules A549 transfectées avec un contrôle non ciblant (NC) et shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ont été ensemencées et incubées pendant une nuit dans des boîtes de Petri de 10 cm de diamètre. Les métabolites cellulaires ont été extraits avec 1 ml de méthanol aqueux à 80 % glacé. Les cellules présentes dans la solution méthanolique ont été détachées par raclage, recueillies dans un nouveau tube et centrifugées à 15 000 × g pendant 15 min à 4 °C. 800 µl de surnageant ont été prélevés et séchés sous vide à haute vitesse. Les culots de métabolites séchés ont ensuite été analysés par LC-MS/MS pour déterminer les concentrations de tryptophane, comme décrit précédemment. Les concentrations de NAD(H) cellulaire dans les cellules A549 (NC et shSLC7A5) ont été mesurées à l'aide d'un kit colorimétrique quantitatif NAD+/NADH (n° K337, BioVision), conformément aux instructions du fabricant. Les concentrations protéiques ont été mesurées pour chaque échantillon afin de normaliser la quantité de métabolites.
Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour déterminer la taille de l'échantillon. Les études métabolomiques antérieures visant la découverte de biomarqueurs15,18 ont servi de référence pour le calcul de cette taille, et notre échantillon s'est avéré adéquat par rapport à ces travaux. Aucun échantillon n'a été exclu de la cohorte. Les échantillons de sérum ont été répartis aléatoirement en un groupe de découverte (306 cas, 74,6 %) et un groupe de validation interne (104 cas, 25,4 %) pour les études métabolomiques non ciblées. Nous avons également sélectionné aléatoirement 70 cas dans chaque groupe du groupe de découverte pour les études métabolomiques ciblées. Les investigateurs ignoraient l'appartenance des échantillons aux groupes lors de l'acquisition et de l'analyse des données LC-MS. Les analyses statistiques des données métabolomiques et des expériences cellulaires sont décrites dans les sections « Résultats », « Légendes des figures » et « Méthodes ». La quantification du tryptophane cellulaire, du NADT et de l'activité glycolytique a été réalisée trois fois indépendamment, avec des résultats identiques.
Pour plus d'informations sur la méthodologie de l'étude, veuillez consulter le résumé du rapport sur le portefeuille naturel associé à cet article.
Les données brutes de spectrométrie de masse (SM) des caractéristiques extraites et les données SM normalisées du sérum de référence sont présentées respectivement dans les données supplémentaires 1 et 2. Les annotations des pics pour les caractéristiques différentielles sont présentées dans les données supplémentaires 3. L'ensemble de données LUAD TCGA peut être téléchargé à l'adresse https://portal.gdc.cancer.gov/. Les données d'entrée pour la construction du graphique sont fournies dans les données sources. Ces données sources sont fournies pour cet article.
Groupe d'étude national sur le dépistage du cancer du poumon, etc. Réduction de la mortalité par cancer du poumon grâce à la tomodensitométrie à faible dose. Nord de l'Angleterre. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR et Prophet, PC. Dépistage du cancer du poumon par tomodensitométrie hélicoïdale à faible dose : résultats de l’étude nationale de dépistage du cancer du poumon (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Réduction de la mortalité par cancer du poumon grâce au dépistage par tomodensitométrie volumétrique dans un essai randomisé. Northern England. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Date de publication : 18 septembre 2023